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文档简介

1、精品文档淋巴细胞分离与计数淋巴细胞分离原理：外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（ Ficoll ）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。.精品文档实验材料：淋巴细胞分离液肝素稀释液（生理盐水）RPMI1640粉末实验设备 ：1ml 移液器、移液管、 5ml 注射器、刻度吸管、 EP管、离心机、显微镜操作流程：在离心管中加入适量淋巴细胞分离液。无菌采集静脉血若干毫升 , 注入盛有肝素的无菌小瓶中，（每 1ml 全血加0.1ml 125-250U/ml 肝素溶液 ), 加盖后立即轻轻摇匀 , 使血液抗凝稀释（外周血：稀释液 =1：2 取肝素

2、抗凝血与等量生理盐水充分混匀）用刻度吸管沿倾斜的管壁，把稀释血缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面 （Ficoll ：稀释血 =1：2）放入离心机 1500r/min 离心 20min（注 : 缓慢加速 1-4 档个 3 分钟 ）用吸管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一离心管中，加入 5 倍以上体积的稀释液（生理盐水）， 1500rpm 10 分钟离心，洗涤细胞。重复洗涤一次， 1500rpm 10 分钟离心。末次离心后，弃上清，加入含有 10小牛血清的 RPMI1640，重悬细胞计数细胞后再调整细胞置所需浓度 .取一滴细胞悬液与一滴 0.2 台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方

3、格内的细胞总数。单个核细胞浓度 ( 细胞数 1 毫升细胞悬液 ) 个大方格内细胞总数10 2( 稀释倍数 )4分离出的淋巴细胞置于培养瓶中二氧化碳培养箱培养。.精品文档注意事项 :每毫升外周血液大约可获 1106 单个核细胞Ficoll 应适量，外周血应充分稀释温度直接影响到 Ficoll 的比重和分离效果在 Ficoll 上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染淋巴细胞计数：实验流程：准备计数板：制备细胞悬液：收集细胞，制成单个细胞悬液加样：用吸管轻轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液，计数：在显微镜下，用 10物镜观察计数板四角大方格中的细胞数计算：将结果代入下式，得出细胞密度胞数 / 毫升原=（4 大格细胞数之和 /4 ） 104.精品文档注意事项：取样计数前，应充分混匀细胞悬液加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡细胞压中线时，数上不数下，数左不数右本法要

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