中文操作手册phosflow小鼠脾细胞胸腺

1、小鼠脾细胞/胸腺细胞 BD Phosflow 操作流程Protocol I (Detergent Method)所需试剂：试剂准备：按照说明书30分钟。蒸水或者去离子水1X Lyse/Fix Buffer （货号：558049）。使用前37C 预热15-按照说明书蒸水稀释1 x Perm/Wash Buffer I （货号：557885）。放置至室温后使用。操作步骤：1.取小鼠组织样本（如脾脏，胸腺，骨髓等），用 PBS 或完全培养基单细胞悬液2. 350g 离心 6- 8 分钟，弃上清3. 混匀细胞（此步动作需要轻柔）4. 以 110 x 106 cells/mL 的浓度将细胞重悬于PBS

2、或完全培养液中。必要时可以用 70m 的滤器过滤去除细胞团块。5. （选做步骤）因前处理过程对细胞信号通路有一定程度的刺激，所以有些细胞需要处理完成后，可以在完全培养基中静息 2-4 小时，以保证细胞恢复到未受刺激状态（参见操作说明）。全称简称货号Phosphate buffered saline containing CaCl2 and MgCl2, 1X, or complete media (eg, RPMI media containing 10% FBS)PBS 或完全培养基细胞刺激剂BD Phosflow Lyse/Fix Buffer, 5X溶血/固定液558049双蒸水BD P

3、harmingen Stain Buffer (FBS)染色液554656BD Phosflow Perm/Wash Buffer I, 10X破膜/液557885BD Pharmingen Fc Block antibody (optional)Fc 阻断抗体553141 or553142BD Phosflow荧光标记的磷酸化蛋白抗体BD 荧光标记的细胞表面抗体（可选）6. 用适当的刺激剂处理细胞，37C 孵育适当的时间（1 到 30 分钟，参见操作说明）。实验需设立未处理样本为对照。7. 刺激处理完毕后，迅速加入 10 倍体积的、预热的 Lyse/Fix Buffer 裂解固定细胞。振荡器

4、低速振荡混匀 5-10 次。8. 37C 孵育 10-12 分钟。9. 600g 离心 6-8 分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于 50L。10. 振荡器低速振荡混匀细胞。11. 细胞：a加入与Lyse/Fix Buffer 相等量的 stain buffer 试剂（货号：554656）。b600g 离心 6-8 分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于 50L。c振荡器低速振荡混匀细胞。12.（选做步骤）：为保证实验结果，若以上步骤红细胞裂解不充分，继续用溶血剂裂解细胞，但此步骤不得超过 2 次。13. 于 110 x 106 细胞中加入 1ml （最少 1ml）Perm/Wash Buffe

5、r I 进行细胞破膜。轻柔混匀后，室温孵育 15-30 分钟。14. 600g 离心 6-8 分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于 50L。15振荡器低速振荡混匀细胞。16. 细胞：a加入与 1ml Perm/Wash Buffer I。b600g 离心 6-8 分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于 50L。c振荡器低速振荡混匀细胞17. 用 Perm/Wash Buffer I 重悬细胞，使细胞终浓度为 510 x 106 cells/mL。18. （选做步骤）每 1 x 106 细胞中加入 0.06 g Fc 封闭抗体（货号：553141 or 553142）。混匀后冰浴 15 分钟。19

6、. 取 100 L 细胞悬液（0.51 x 106 细胞）置于 12 x 75-mm BD Falcon试管中，参考抗体说明书用量加入相应 BD Phosflow 抗体。20. 混匀后室温避光孵育 60 分钟。21. 细胞：a加入至少 3ml Perm/Wash Buffer I。b600g 离心 6-8 分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于 50L。c振荡器低速振荡混匀细胞。22加入约 500 L 的Perm/Wash Buffer I 重悬细胞，混匀后上机检测。Protocol II and III (Mild or Harsh Alcohol Method)*根据所用的表面标记抗体和特异

7、性磷酸化蛋白抗体选择使用 Perm Buffer II 或者 Perm Buffer III 。更多信息请详见 如下：Tested Surface Markers 及 BD FACSelect Buffer Compatibility Resource .所需试剂：试剂准备：按照说明书30分钟。蒸水或者去离子水1X Lyse/Fix Buffer （货号：558049）。使用前37C 预热15-Perm Buffer II（货号：558052）或 III（558050）用前需置于-20C-4C预冷。操作步骤：1.取小鼠组织样本（如脾脏，胸腺，骨髓等），用 PBS 或完全培养基制成单细胞悬液2.

8、 350g 离心 6- 8 分钟，弃上清3.混匀细胞（此步动作需要轻柔）4. 以 110 x 106 cells/mL 的浓度将细胞重悬于PBS 或完全培养液中。必要时可以用 70m 的滤器过滤去除细胞团块。5. （选做步骤）因前处理过程对细胞信号通路有一定程度的刺激，所以有些细胞需要成后，在完全培养基中静息 2-4 小时，以保证细胞恢复到未受刺激状态（参见操作说明）。处理完全称简称货号Phosphate buffered saline containing CaCl2 and MgCl2, 1X, or complete media (eg, RPMI media containing 10

9、% FBS)PBS 或完全培养基细胞刺激剂BD Phosflow Lyse/Fix Buffer, 5X溶血/固定液558049双蒸水BD Pharmingen Stain Buffer (FBS)染色液554656BD Phosflow Perm Buffer II*破膜剂 II558052*BD Phosflow Perm Buffer III*破膜剂 III558050*BD Pharmingen Fc Block antibody (optional)Fc 阻断抗体553141 or553142BD Phosflow荧光标记的磷酸化蛋白抗体BD 荧光标记的细胞表面抗体（可选）6. 用适

10、当的刺激剂处理细胞，37C 孵育适当的时间（1 到 30 分钟，参见操作说明）。实验需设立未处理样本为对照。7.刺激处理完毕后，迅速加入 10 倍体积的、预热的 Lyse/Fix Buffer 裂解固定细胞。振荡器低速振荡混匀 5-10 次。8. 37C 孵育 10-12 分钟。9. 600g 离心 6-8 分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于 50L。10. 振荡器低速振荡混匀细胞。11.细胞：a加入与Lyse/Fix Buffer 相等量的 stain buffer（货号：554656）。b600g 离心 6-8 分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于 50L。c振荡器低速振荡。12.（选做

11、步骤）：为保证实验结果，若以上步骤红细胞裂解不充分，继续用溶血剂裂解细胞，但此步骤不得超过 2 次。13于 110 x 106 细胞中加入 1ml （最少 1ml）预冷的Perm Buffer II 或 II 进行细胞破膜。振荡器低速振荡，冰浴 30 分钟。14.细胞：a. 加入至少 3ml Stain Buffer 重悬细胞（对应每 1ml Perm Buffer）。b. 600g 离心 6-8 分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于 50L。c. 振荡器低速振荡混匀细胞。15. 重复细胞 2 次：a. 加入与步骤 9 中相等量的 Stain Buffer。b. 600g 离心 6-8 分钟，

12、弃上清，试管中残余液体量不多于 50L。c. 振荡器低速振荡混匀细胞。d.重复步骤 a-c。16. 将细胞重悬于 Stain Buffer，使细胞终浓度为 510 x 106 cells/mL。17. （选做步骤）每 1 x 106 细胞中加入 0.06 g Fc 封闭 抗体（货号：553141 or 553142）。混匀后冰浴 15 分钟。18.取 100 L 细胞悬液（0.51 x 106 细胞）置于 12 x 75-mm BD Falcon试管中，参考抗体说明书用量加入相应 BD Phosflow 抗体。19. 混匀后室温避光孵育 60 分钟。20. 细胞：a加入至少 3ml Stain

13、 Buffer。b600g 离心 6-8 分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于 50L。c振荡器低速振荡混匀细胞。21加入约 500 L 的 Stain Buffer 重悬细胞，混匀后上机检测。Protocol IV (Harsh Detergent Method)所需试剂：试剂准备：按照说明书30分钟。蒸水或者去离子水1X Lyse/Fix Buffer （货号：558049）。使用前37C 预热15-按照说明书用1X PBS稀释1X 或 0.5X Perm Buffer IV （货号：560746）。使用前置于室温。根据操作说明及如下BD FACSelect Buffer Compatib

14、ility Resource 选择使用 1X 或 0.5X PermBuffer IV。因Perm Buffer IV破膜能力最强，针对Perm Buffer IV的操作过程中，有Perm Buffer IV存在情况下的振荡、混匀动作必须轻柔，以防细胞破碎。操作步骤：1.取小鼠组织样本（如脾脏，胸腺，骨髓等），用 PBS 或完全培养基单细胞悬液2. 350g 离心 6- 8 分钟，弃上清3. 混匀细胞（此步动作需要轻柔）4. 以 110 x 106 cells/mL 的浓度将细胞重悬于PBS 或完全培养液中。必要时可以用 70m 的滤器过滤去除细胞团块。5. （选做步骤）因前处理过程对细胞信号

15、通路有一定程度的刺激，所以有些细胞需要成后，在完全培养基中静息 2-4 小时，以保证细胞恢复到未受刺激状态（参见操作说明）。处理完全称简称货号Phosphate buffered saline containing CaCl2 and MgCl2, 1XPBSComplete media (eg, RPMI media containing 10% FBS) (optional)完全培养基细胞刺激剂BD Phosflow Lyse/Fix Buffer, 5X溶血/固定液558049双蒸水BD Pharmingen Stain Buffer (FBS)染色液554656BD Phosflow

16、Perm Buffer IV, 10X破膜剂 IV560746BD Pharmingen Fc Block antibody (optional)Fc 阻断抗体553141 or553142BD Phosflow荧光标记的磷酸化蛋白抗体BD 荧光标记的细胞表面抗体（可选）6. 用适当的刺激剂处理细胞，37C 孵育适当的时间（1 到 30 分钟，参见操作说明）。实验需设立未处理样本为对照。7. 刺激处理后，迅速加入 10 倍体积的、预热的Lyse/Fix Buffer 裂解固定细胞。振荡器低速振荡混匀 5-10 次。8. 37C 孵育 10-12 分钟。9. 600g 离心 6-8 分钟，弃上清

17、，试管中残余液体量不多于 50L。10. 振荡器低速振荡混匀细胞。11.细胞：a加入与Lyse/Fix Buffer 相等量的 stain buffer（货号：554656）。b600g 离心 6-8 分钟，弃上清，试管中残余液体量不多于 50L。c振荡器低速振荡混匀细胞。12.（选做步骤）：为保证实验结果，若以上步骤红细胞裂解不充分，继续用溶血剂裂解细胞，但此步骤不得超过 2 次13. 向 0.52.0 x 106 细胞中缓慢、滴加 1ml （最少 1ml）预冷的Perm Buffer IV 进行细胞破膜。振荡器低速振荡混匀细胞，室温孵育 15-20 分钟。14. 600g 离心 6-8 分钟，弃上清，将流式管倒置在吸水纸上，吸去多余液体，试管中残余液体量不多于 50L 。15. 振荡器低速振荡混匀细胞。16.细胞 2 次：a. 加入至少 3ml Stain Buffer。b. 600g 离心 6-8 分钟，弃上清，将流式管倒置在吸水纸上，吸去多余液体，试管中残余液体量不多于 50L。c. 振荡器低速振荡。d.重复步骤 a-c。17. 将细胞重悬于 Stain Buffer，使细胞终浓度为 510 x 106 cells/mL。18.（选做步骤）每 1 x 10