口虾蛄提取物对体外人鼻咽癌细胞转移潜能的影响

1、口虾蛄提取物对体外人鼻咽癌细胞转移潜能的影响【摘要】目的讨论口虾蛄提取物对体外人鼻咽癌细胞系NE-2Z转移潜能的影响。方法用细胞-基质粘附实验、细胞运动实验及侵袭实验检测口虾蛄提取物对NE-2Z细胞粘附、运动及侵袭才能的影响；免疫细胞化学法检测其对P-2、P-9及D44v6蛋白表达的影响。结果口虾蛄提取物能以量-效方式抑制NE-2Z细胞体外运动及侵袭才能P0.01，但对NE-2Z细胞-基质粘附才能无影响P0.05。且口虾蛄提取物能降低P-2、P-9及D44v6蛋白强阳性表达率P0.01。结论口虾蛄提取物可抑制体外NE-2Z细胞的运动及侵袭才能,其机制可能与下调D44v6、P-9和P-2蛋白表达

2、有关。【关键词】口虾蛄口虾蛄提取物鼻咽肿瘤肿瘤转移近年来，研究发现海绵、海藻及珊瑚等多种海洋生物均含丰富的抗瘤活性物质1，提示从海洋生物挑选抗肿瘤新药具有广阔的前景。口虾蛄(ratsquilla)，又称濑尿虾，属于节肢动物门，是日常食用的海洋生物之一。目前，有关口虾蛄抗肿瘤的报道甚少。本课题组近年研究发现口虾蛄提取物能抑制人低分化鼻咽癌细胞系NE-2Z的生长2，3，但能否抗肿瘤侵袭及转移尚不清楚。本文旨在讨论口虾蛄提取物对NE-2Z细胞转移潜能的抑制作用，为口虾蛄抗肿瘤作用提供实验根据。1材料NE-2Z为人低分化鼻咽癌细胞系,由广东医学院肿瘤研究所提供。2方法2.1口虾蛄有效成分提取与配制新颖

3、口虾蛄暴晒干后粉碎成粉末，用95%乙醇浸泡3次，每次浸泡液过滤混匀在56蒸发提纯。提纯物呈膏状，每克药物相当于生药3.81g。提取物用二甲基亚砜DS配成1000gL-1，4保存，临用时用培养液稀释成所需浓度，以下实验均分4组：溶剂对照组、口虾蛄提取物低浓度组200.0gL-1、口虾蛄提取物中浓度组400.0gL-1及口虾蛄提取物高浓度组800.0gL-1。2.2细胞-基质粘附实验atrigel按2.0g/孔铺于96孔培养板中，风干过夜。NE-2Z细胞常规培养，以每孔4104/100l接种，并参加不同浓度的口虾蛄提取物，每组设12个平行孔，培养8h后倒掉培养液，结晶紫100l/孔染色10in，P

4、BS洗涤3次。参加醋酸乙醇100l/孔，酶标仪测定A570n值。实验重复2次。2.3细胞侵袭及运动实验Transell上室腔内参加稀释好的atrigel10g)，风干过夜。24孔培养板内参加10g/l纤维粘连蛋白的完全培养液600l/孔。搜集NE-2Z细胞，用含1%牛血清白蛋白的RPI1640制成1106/l细胞悬液，以100l/室参加上室腔，同时参加不同浓度的口虾蛄提取物，每组设平行小室3个，小室浸于24孔板的条件培养基中培养24h，取小室，甲醇丙酮11固定10in，擦去未穿膜的细胞，HE染色，光学显微镜下随机选择5个视野，计数细胞数目，取均值。运动试验除不铺atrigel外，其余步骤一样。

5、2.4免疫细胞化学法NE-2Z细胞接种在一次性塑料培养皿中，同时参加不同浓度的口虾蛄提取物，常规培养24h后弃培养液，用PBS冲洗3次，冷丙酮：甲醇11固定10in，晾干。免疫组化染色：参照S-P试剂盒说明。结果观察：每组选用上下左右中五个区域，记数500个细胞，胞浆或和胞膜着色淡黄为弱阳性+，着色棕黄为阳性+，着色棕褐为强阳性+，无着色为阴性-。2.5统计学分析用统计学软件SPSSfrind11.5中单因素方差分析ne-ayANVA(PstHTest:LSDtest)及RTableDesriptivestatistis(rsstabs,hi-square)。转贴于论文联盟.ll.3结果3.1

6、粘附实验结果不同浓度口虾蛄提取物组D值变化不大。溶剂对照组、口虾蛄提取物200.0，400.0，800.0gL-1组D值分别为1.3130.073，1.3200.058，1.3040.052及1.3060.085。组间差异无统计学意义P0.05。3.2细胞运动实验结果随口虾蛄提取物浓度的增高，穿PVPF膜的细胞数渐减少见图1，呈量-效关系。溶剂对照组及口虾蛄提取物低、中、高浓度组穿膜细胞数分别为84.675.15，36.075.46，31.002.60及15.602.16。组间差异有显著性P0.01。3.3细胞侵袭实验结果随口虾蛄提取物浓度的增高，穿PVPF膜的细胞数也渐减少见图2，呈量-效关

7、系。溶剂对照组及口虾蛄提取物低、中、高浓度组侵袭细胞数分别为102.273.91，54.824.39，45.602.03及38.472.48。组间差异有显著性P0.01)。3.4免疫细胞化学法结果NE-2Z细胞D44v6主要在细胞膜上表达，均呈阳性或强阳性表达。随口虾蛄提取物浓度的增高D44v6表达有下降的趋势，溶剂对照组及口虾蛄提取物低、中、高浓度组D44v6强阳性表达率分别为46.6%(233/500)、45.6%(228/500)，38.0%(190/500)和30.6%(153/500)，组间差异有显著性(P0.01)。P-9及P-2主要表达NE-2Z细胞膜及胞浆，呈阳性或强阳性表达。

8、溶剂对照组及口虾蛄提取物低、中、高浓度组P-9强阳性表达率分别为48.8%(244/500)，43.6%(218/500)，29.2%(146/500)及29.0%(145/500)；而P-2强阳性表达率分别为28.0%(140/500)，10.0%(50/500)，6.6%(33/500)及6.0%(30/500)。两者强阳性表达率均随口虾蛄提取物浓度增高而降低，差异均具有显著性P0.01)。4讨论鼻咽癌又称“广东癌，放疗为其治疗的主要手段，但晚期患者的5年生存率仅30左右，放疗失败的主要原因是部分复发和远处转移，其中远处转移是患者死亡的主因。在恶性肿瘤侵袭和转移过程中，癌细胞间及其与细胞外

9、基质、正常细胞间的粘附作用、细胞外基质的降解和癌细胞运动游走才能起着重要作用，是决定恶性肿瘤能否发生侵袭转移的3个关键因素。因此，通过观察药物对癌细胞粘附、侵袭以及运动才能的影响可判断其能否抑制肿瘤转移潜能。本实验粘附实验结果发现不同浓度口虾蛄提取物组D值变化不大P0.05，提示其对NE-2Z细胞-基质粘附才能可能无抑制作用。细胞运动实验结果发现随着口虾蛄提取物浓度的增高，穿过PVPF膜的NE-2Z细胞数渐减少，呈量-效关系P0.01)，提示其对NE-2Z细胞运动才能有抑制作用。而细胞侵袭实验结果显示随口虾蛄提取物浓度的增高，侵袭人工基底膜后穿过PVPF滤膜的NE-2Z细胞数也渐减少，呈量-效

10、关系P0.01)，提示其对NE-2Z细胞侵袭才能也有抑制作用。D44为细胞外表胯膜糖蛋白，研究说明D44拼接异构体的D44v6与癌侵袭、转移亲密相关4，D44v6异常表达可能与鼻咽癌转移亲密相关5，D44v6可通过影响了肿瘤细胞的运动才能而参与肿瘤的侵袭转移过程6。本实验结果发现随口虾蛄提取物浓度的增高D44v6表达有下降的趋势，组间差异有显著性P0.01)，提示了口虾蛄提取物对D44v6表达有抑制作用，从而降低NE-2Z细胞的运动才能。基质金属蛋白酶atrixetallprtEinase，P家族成员中的型胶原酶与恶性肿瘤侵袭及转移关系最亲密，是近年研究热点之一。目前发现型胶原酶有两种:72K

11、D型和92KD型型胶原酶，即P-2及P-9，两者的过度表达与肺、前列腺及乳腺等多种器官恶性肿瘤的侵袭和转移亲密相关。有研究说明P-9和P-2与鼻咽癌侵袭转移有关7，8。本实验结果显示P-2及P-9蛋白表达也随口虾蛄提取物浓度增高而降低，呈量效关系P0.01)，提示了口虾蛄提取物可抑制P-2及P-9表达，从而降低NE-2Z细胞的侵袭才能。综上所述，口虾蛄提取物可能同时抑制了D44v6、P-9和P-2蛋白表达而降低NE-2Z细胞的运动及侵袭才能，从而抑制了NE-2Z细胞的转移潜能。由此可见，口虾蛄提取物中可能含有抗鼻咽癌侵袭及转移的活性成分，至于其起作用的详细活性成分是什么，有待进一步的研究。【参

12、考文献】1T.LukeS,EriA,KerryP,etal.arinenaturalprdutsasantianerdrugsJ.lanerTher，2022,4(2):333.2顾帝水，黄培春，孔霞，等.口虾蛄提取物对人鼻咽癌裸鼠移植瘤生长的影响J.现代中西医结合杂志,2022,14(14):1825.3叶才果，潘海燕，黄培春，等.海洋来源的口蛄虾生物碱的别离纯化和抗鼻咽癌作用研究J.时珍国医国药,2022,19(12):2965.4Kainz,Tepfer,KhlbergerP,etal.IunhistheialdetetinfadhesinleuleD44splievariantsinlyphndeetastasesfervialanerJ.IntJaner,1997，74:185.5卓明英,杨军,林昶，等.D44v6基因蛋白在鼻咽癌的表达及意义J.临床肿瘤学杂志,2001,6(1):25,31.6AfifyA,PurnellP,NguyenL.RlefD44sandD44v6nhuanbreastanerelladhesin,igratin,andinvasinJ.ExplPathl，2022,86(2):95.7ZhangXX,GuY,YeQ,etal.StudyftherelatinbeteenP2、P9andnasph