食品生物技术概论 廖威 第三章 酶工程及其在食品工业中的应用课件

1、第三章 酶工程及其在食品工业中的应用食品生物技术概论酶工程的概述酶工程（enzyme engineering)又称酶技术，是指利用酶催化的作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需要的产品的过程，它是酶学理论与化学技术相结合而形成的一门新技术。酶工程是生物工程的重要组成部分，它与基因工程、细胞工程、发酵工程相互依存、相互促进，它们在生物工程的研究、开发和产业化过程中要靠彼此合作来实现。 一、酶工程的内容 1.酶工程的分类：（1）化学酶工程：自然酶、化学修饰酶、固定化酶、化学人工酶的研究和应用。（2）生物工程酶： 用基因工程技术大量生产酶（克隆酶）； 修饰酶基因产生遗传修饰酶（突变酶）；

2、 设计新酶基因，合成自然界不曾有的酶（新酶）。（8）抗体酶、人工酶和模拟酶 抗体酶是一类具有催化活性的抗体。是抗体的高度专一性与酶的高效催化能力二者巧妙结合的产物。其研究内容是：抗体酶的制备、结构、特性、作用机理、催化反应类型、应用等。人工酶是用人工合成的具有催化活性的多肽或蛋白质。据1977年Dhar等人报道，人工合成的GluPheAlaGluGluAlaSerPhe八肽具有溶菌酶的活性。其活性为天然溶菌酶的50%。利用有机化学合成的方法合成了 些比酶结构简单得多的具有催化功能的非蛋白质分子。这些物质分子可以模拟酶对底物的结合和催化过程。既可以达到酶催化的高效率，又能够克服酶的不稳定性。这样

3、的物质称为模拟酶。用环糊精已成功地模拟了胰凝乳蛋白酶等多种酶。酶的生产酶的提取酶的分离纯化制成酶制剂后直接利用制成固定化酶（或固定化细胞）后利用用于治疗疾病用于加工和生产一些产品用于化验诊断和水质临界测定用于生物技术其他分支领域酶制剂的利用酶制剂的生产 2.微生物发酵法制酶对生产菌的要求 安全可靠，非致病菌，不会产生有毒物质。产酶性能稳定，不易退化，不易感染噬菌体。繁殖快，产酶量高，而且最好产生胞外酶。能利用廉价的原料，发酵周期短，易培养。产生的酶容易分离纯化。3. 发酵方法与发酵条件 （1）发酵方法固体发酵法：以麸皮、米糠等为基本原料，加无机盐和适量水分（通常50%左右）进行的微生物培养。方

4、法：浅盘法（培养基不超过5cm） 转鼓法（培养基在转鼓内翻动） 通气式厚发酵（培养基可达2030mm）3. 发酵方法与发酵条件 液体发酵法：利用合成的液体培养基在发酵罐内进行搅拌通气培养的发酵方法。方法：间歇发酵法 连续发酵法 3. 发酵方法与发酵条件（2）发酵条件的控制 发酵条件既要有利菌体生长繁殖，又不影响酶的形成。一般处理是先确定菌体生长的最适条件，然后作出调整以满足酶生成的需要。首先，培养基组成对菌的生长和酶的合成具有最直接的影响。其次，通风量、培养温度等因素不仅影响菌体生长，也影响酶的合成。一般来说在低于生长温度下产酶量高。培养温度还影响酶活力的稳定性。另外，在生产中掌握适宜酶的回收

5、期时也很重要，对于大多数胞外酶来说，酶合成与菌株生长大致平行，生长停止时酶产量达最大，再培养酶产量多要下降。 4. 产酶常用的微生物（1）细菌：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等（2）放线菌：链霉菌（3）霉菌：黑曲霉、米曲霉、红曲霉、青霉、木霉、根霉、毛霉等（4）酵母：啤酒酵母、假丝酵母 5.微生物酶的发酵生产微生物酶的发酵生产： 在人工控制的条件下，有目的利用微生物培养来生产所需的酶。 包括：培养基，发酵方式的选择，发酵条件的控制管理等。 （1）培养基碳源氮源无机盐类生长因子pH （2）酶的发酵生产方式固体发酵：用于真菌的酶生产，如米曲霉生产淀粉酶，曲霉和毛霉生产蛋白酶。液体深层发酵：控制发酵条件温度

6、、通气和搅拌、pH等发酵条件。 （3）提高酶产量的措施选育优良的产酶菌株添加诱导物：酶的作用底物，酶的反应产物，酶的底物类似物。降低阻遏物浓度表面活性剂添加产酶促进剂 二、酶的分离纯化酶的分离纯化：是指从微生物的发酵液或动植物组织提取液及细胞培养液中得到不同纯度、高质量的酶产品。酶分离纯化的方法是根据酶的蛋白质特性而建立的。酶的分离纯化细胞破碎酶的提取离心分离过滤与膜分离层析分离电泳分离萃取分离浓缩干燥结晶 1、细胞破碎除胞外酶之外，绝大多数酶都存在于细胞内部。先收集细胞，破碎细胞，让酶从细胞内释放出来，然后进行酶的提取和分离纯化细胞破碎的方法：机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法、酶促破碎法等

7、。 细胞破碎方法及原理分类细胞破碎方法细胞破碎原理机械破碎法捣碎法研磨法匀浆法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎物理破碎法温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，从而使细胞破碎化学破碎法添加有机溶剂添加表面活性剂通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎酶促破碎法自溶法外加酶制剂法通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构破坏，而使细胞破碎 2、酶的提取酶的提取过程就是在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分地溶解到提取液中的过程。酶的提取方法：盐溶液提取法、酸溶液提取法、碱溶液提取法、有机溶剂提取法等。 酶的主要

8、提取方法提取方法用于提取的溶剂提取的酶的性质盐溶液提取0.020.5mol/L的盐溶液在低盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取pH26的水溶液在稀酸溶液中溶解度较大且稳定性较好的酶碱溶液提取pH812的水溶液在稀碱溶液中溶解度较大且稳定性较好的酶有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂与脂类结合或者含较多非极性基团的酶 3、酶的分离纯化酶的纯化就是把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来。包括：沉淀、过滤、层析、电泳、萃取、结晶、干燥等。 4、沉淀分离沉淀分离就是通过改变某些条件或添加某些物质，使酶的溶解度降低，从溶液中沉淀析出而与其他溶质分离的技术过程。包括：盐析沉淀法、等电点沉淀法、有机溶剂沉淀法

9、、复合沉淀法。沉淀分离方法沉淀分离方法分离原理盐析沉淀法利用酶（蛋白质）在不同盐浓度下的溶解度不同的原理，使酶或者杂质析出沉淀，从而使酶与杂质分离等电点沉淀法利用两性电解质在等电点时溶解度最低以及不同的两性电解质有不同的等电点的特性，调节溶液的pH，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离有机溶剂沉淀法利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，使酶与杂质分离复合沉淀法在酶液中加入某些性质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离 5、离心分离离心分离就是借助于离心机旋转所产生的离心力，使大小不同、密度不同的物质分离的技术过程。离心机：低速离心

10、机、高速离心机、超速离心机。 5、离心分离低速离心机：最大转速8000r/min。主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。高速离心机：最大转速（1）104r/min。用于细胞碎片和细胞器的分离超速离心机：最大转速（12）104r/min。主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器和病毒的分离纯化、沉淀系数和相对分子质量的测定等 。 6、过滤分离过滤是借助于过滤介质将大小不同、形状不同的物质分离的技术过程 。过滤介质：滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷和各种高分子膜等。过滤类型：膜过滤（微滤以及超滤、反渗透、透析、电渗析等采用各种高分子膜作为过滤介质），非膜过滤（将粗滤及部分微滤采用

11、高分子膜以外的物质作为过滤介质）。过滤的种类及特性类别截留的颗粒大小截留的主要物质过滤介质粗滤2m酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等滤纸、滤布、纤维多孔陶瓷等微滤0.2 2m细菌、灰尘等微过滤、微孔陶瓷超滤20A至2m病毒、生物大分子等超滤膜反渗透 20A生物小分子、盐、离子等反渗透膜 7、层析分离层析分离是 利用混合液中各组分的物理化学性质（分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数）的不同，使各组分以不同比例分配在两相中。其中一个相为固定相，另一个相为流动相，当流动相流经固定相时，各组分以不同发速度移动，从而使不同的组分分离纯化。层析分离方法层析方法分离依据吸附层析利用

12、吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离分配层析利用各组分在两相中的分配系数不同而使各组分分离离子交换层析利用离子交换剂上的可解离基团对各种离子的亲和力不同而达到分离目的凝胶层析以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中各组分的相对分子质量不同而使各组分分离亲和层析利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，使生物分子分离纯化层析聚焦将酶等两性物质的等电点特性与离子交换层析的特性结合在一起，实现组分分离 8、电泳分离带电离子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程称为电泳。物质颗粒在电场中的移动方向：带正电荷的颗粒向电场的阴极移动；带负电荷的颗粒向阳极移动；净电荷为零的颗粒

13、在电场中不移动。颗粒在电场中的移动速度主要取决于其本身所带的净电荷量，同时受颗粒形状、大小、电场强度、溶液的pH、离子强度、支持体的特性等外界条件的影响。 8、电泳分离电泳的方法：纸电泳、薄层电泳、薄膜电泳、凝胶电泳、自由电泳、等电聚焦电泳等。在酶学研究中，电泳技术主要用于酶的纯度鉴定、酶的分子质量测定、酶等电点测定以及少量酶的分离纯化。 9、萃取分离萃取分离是利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。两相指的是互不相溶的两个液相或其他液体。按照两相的组成不同，萃取可分为有机溶剂萃取、双水相萃取、超临界萃取等。10、结晶结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。结晶的方法：盐析结晶法、有机溶

14、剂结晶法、透析平衡结晶法、等电点结晶法等。11、干燥干燥是将固体、半固体或浓缩液中的水分或其他溶剂除去一部分，以获得含水分较少的固体物质的过程。酶经过干燥后，可以提高酶的稳定性，利于产品保存、运输和使用。常用的干燥方法：真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥和吸附干燥等。3、在酶的分离纯化工业中必须注意的问题（1）要注意防止酶变性失活除少数情况外，所有操作必须在低温下进行，特别是有机溶剂存在时更要特别小心；大多数酶在pH4或pH10的条件下不稳定，故不能过酸过碱；酶溶液常易在表面上形成泡沫而变性，故应防止泡沫的形成；重金属能引起酶失效，有机溶液能使酶变性，微生物污染、蛋白酶能使酶分解，都必须予

15、以防止。（2）酶的分离纯化的目的是将酶以外的所有杂质尽可能除去，因此在不破坏酶所需的条件下，可使用各种“激烈”的手段，此外，由于酶和它的底物、抑制剂等具有亲和性，当这些物质存在时，酶的理化性质和稳定性又会发生一定的变化，从而提供了更多可供采用的条件和方法。（3）通过检测酶活性，跟踪酶的来龙去脉，为选择适当方法和条件提供了直接依据。在工作过程中从原材料开始每步都必须检测酶活性，一个好的方法和措施是使酶的纯度提高倍数大，活力回收高，同时重复性好。 二、化学人工酶根据酶的催化原理，模拟酶的生物催化功能，用有机化学和生物学的方法合成具有专一催化功能的酶的模拟物人工酶（arti-ficial enzym

16、e）。人工酶的制作有两种：半合成酶和全合成酶。 二、化学人工酶1.半合成酶将具有一定结构和功能的物质与特异的蛋白质结合，使可形成新的生物催化剂半合成酶(Semisyhtetie emyme)。与金属或金属有机物的结合。有的半合成酶是与具有催化活性的金属或金属有机物结合形成的。与特异性的物质结合。有的半合成酶是与具有特异性的物质相结合而形成的。 二、化学人工酶 2.全合成酶这类人工酶不是蛋白质，而是有机物，通过加入酶的催化基团与控制空间的构象，像自然酶那样能选择性地催化化学反应，包括小分子有机物(大多为金属络合物)、抗体酶(催化抗体)和人工聚合物酶。小分子有机物全合成酶。氨肽酶全合成酶、转氨全合

17、成酶、ATP水解全合成酶。人工聚合物酶。 一、固定化酶的特点优点：不溶于水，易于与产物分离；可反复使用；可连续化生产；稳定性好；酶反应过程可以加以严格控制；产物中没有酶的残留，简化了工业设备；可以增加产物的得率，提高产物的质量；酶使用效率高，成本降低。 一、固定化酶的特点缺点：固定化时，酶活力有损失；增加了固定化的成本，在生产初期投资大；只能用于水溶性底物，而且较适用于小分子底物，对大分子底物不适宜；与完整菌体相比，不适于多酶反应；胞内酶必须经过酶的分离过程。酶反应器和酶传感器 一、酶反应器酶反应器是利用游离酶或固定化酶将底物转化成产物的装置。根据使用对象的不同，可以分为游离酶反应器和固定化酶

18、反应器。发酵生产过程示意图过程调控 发酵罐 灭菌原料预处理 产物分离提纯 产品菌种培养空气除菌能量热量生物催化反应过程示意图过程调控生物催化反应器 底物产物分离提纯 产品生物催化剂制备能量生物反应器的特点优良的生物反应器应具备：1.严密的结构2.良好的液体混合性能3.高效的传质、传热性能4.配套而可靠的检测和控制仪表 酶反应器较发酵罐简单酶反应器：用于游离或固定化酶（细胞）进行催化反应的容器及其附属设备。分类：按结构分为：搅拌罐式反应器鼓泡式反应器填充床式反应器流化床式反应器膜反应器喷射反应器按操作方式：间歇（分批）式连续式半连续式（包括流加）理想型： 连续操作活塞式反应器（CPFR） 连续操

19、作搅拌式反应器（CSTR）（一）搅拌罐式反应器（Stirred Tank Reactor, STR）组成：反应罐搅拌器保温装置分类：分批搅拌罐式反应器流加分批搅拌罐式反应器连续搅拌罐式反应器1、分批搅拌罐式反应器(BSTR) 将酶和底物溶液一次性加到反应器中，在一定条件下反应一段时间，然后将反应液全部取出。1 分批搅拌反应器 （Batch Stirred Tank Reactor, BSTR） 反应器结构简单，不需要特殊装置，适与小规模试验缺点是：操作麻烦，固定化酶经反复回收使用时，易失去活性，故在工业生产中，间歇式酶反应器很少用于固定化酶，但常用于游离酶。2、连续搅拌罐式反应器（Contin

20、uous Stirred Tank Reactor, CSTR） 催化剂采用颗粒状的固定化酶，少数应用片状固定化酶。 运转过程中要不断分出部分反应液，同时补充等量的新鲜底物溶液，为不致使酶随反应液流失，所以在它的出口处通常有滤膜。 适于有底物抑制场合。 缺点是：搅拌浆剪切力大，易打碎磨损固定化酶颗粒3 连续搅拌罐-超滤反应器酶循环（二）填充（固定）床式反应器（PBR） 固定化酶堆叠在一起，固定不动，底物溶液按照一定的方向以一定的速度流过反应床，通过底物溶液的流动，实现物质的传递和混合。填充床反应器（Packed Reactor,PBR）,优点是：高效率、易操作、结构简单等，因而，PBR是目前工

21、业生产及研究中应用最为普遍的反应器。它适用于各种形状的固定化酶和不含固体颗粒、黏度不大的底物溶液，以及接近平推流，当有产物抑制时，可获得高转化效率。缺点是：传质和热系数相对较低，固定化酶颗粒大小会影响压降和内扩散阻力。当底物溶度含固体颗粒或黏度很大时，不宜采用PBR。三、流化床反应器（FBR） 底物溶液以足够大的流速向上通过固定化酶床层，使固体颗粒处于流化状态。 可用于处理粘性强和含有固体颗粒的底物，或用于需要供应气体或排放气体的反应。适用于固定化酶进行连续催化反应。流化床反应器（Fluidized Bed Reactor, FBR）。FBR可用于处理黏度较大和含有固体颗粒的底物溶度，同时，亦

22、可用于需要供气体或排放气体的酶反应（即固、液、气三相反应）。但因FBR混合均匀，故不适用于有产物抑制的酶反应。四、鼓泡式反应器 (bubble column reactor, BCR ) 利用从反应器底部通入的气体产生的大量气泡，在上升过程中起到提供反应底物和混合两种作用的一类反应器，是一种无搅拌装置的反应器。五、膜反应器 将酶催化反应与半透膜的分离作用组合在一起而成的反应器。膜反应器（membrane reactor, MR）可以用于游离酶的催化反应，也可以用于固定化酶的催化反应。用于固定化酶催化反应的膜反应器是将酶固定在具有一定孔径的多孔薄膜中，而制成的一种生物反应器。膜反应器可以制成平板型、螺旋型、管型、中空纤维型、转盘型等多种形状。常用的是中空纤维反应器。六、喷射式反应器 利用高压蒸汽的喷射作用，实现酶和底物的混合，进行高温短时催化反应的一种反应器。反应器类型适用的操作方式适用的酶特点搅拌罐式反应器分批式,流加分批式连续式,游离酶固定化酶反应比较完全，反应条件容易调节控制。填充床式反应器连续式固定化酶密度大，可以提高酶催化反应的