导流杂交基因芯片技术在人乳头瘤病毒基因分型的应用

1、导流杂交基因芯片技术在人乳头瘤病毒基因分型的应用【摘要】目的讨论对人乳头瘤病毒(HPV)感染进展准确快速基因诊断和分型的方法。方法采用导流杂交基因芯片技术和实时荧光PR对75例疑似HPV感染的标本进展基因诊断和分型。结果基因芯片阳性28例,其中单一感染21例,多重感染7例；实时荧光PR阳性25例。二者在阳性结果中有很好的一致性。结论导流杂交基因芯片技术合适临床筛查HPV感染及对HPV进展基因分型。【关键词】乳头瘤病毒人基因型寡核苷酸序列分析原位杂交1材料与方法1.1材料1.1.1标本来源、采集、保存75例标本取自2022年6-12月福建医科大学附属协和医院疑似HPV感染的门诊女性患者,年龄(2

2、610.6)岁(1839岁)。采集宫颈口棉拭子标本,将取样后的棉拭子放入备有无菌生理盐水1L的加盖微量离心管(1.5L)中,采集的样本在室温放置2h,4保存24h,-20保存3个月,样本防止反复冻融。1.1.2试剂及仪器HPVDNA抽提试剂盒(QIAini试剂盒,德国QIAGEN公司),HPV基因分型检测试剂盒(中国凯普生物科技),可检测21种HPV亚型,包括13种高危亚型(16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59和68型)、5种低危亚型(6,11,42,43和44型)和3种中国人群常见亚型(53,66和P8304型)。另外在膜上还包括用于质量控制的阴性对照点、内

3、对照点(用于监测PR反响)和Bitin对照点(用于监测显色系统)；HPV6/11、16、和18型实时荧光PR检测试剂盒(深圳匹基生物)；扩增仪(PE9700，美国ABI公司)；荧光定量PR仪(Lightyler，瑞士Rhe公司)；医用核酸分子快速杂分仪中国凯普公司。1.2方法1.2.1标本DNA提取取上述液体0.5L,13000r/in离心1in,弃上清液,利用QIAini试剂盒提取DNA,详细操作步骤按试剂盒说明书。1.2.2Hybrax法检测21种HPV亚型1.2.2.2导流杂交将扩增后的PR产物加热变性后冰浴,同时将固定有核酸探针的膜固定在杂交仪上,进展预杂交。把PR产物加到薄膜上,让样

4、品流入膜内进展导流杂交,清洗除去未结合的DNA,整个杂交过程保持在45。1.2.2.3芯片显色及结果判读用封阻液封闭膜,孵育5in,重复2次。排出封阻液后参加酶标液,25温育3.5in。用冲洗缓冲液彻底冲洗膜,除去未结合的酶标液,后参加NBT/BIP底物显色35in。在显色后1h内分析结果。1.2.3实时荧光PR测定HPV亚型按照试剂说明书对每份标本检测HPV6/11、16和18等4种亚型。1.3统计学处理2种方法检测结果比拟用秩和检验,P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1Hybrax法检测所有膜上阴性对照结果均为阴性,内对照点和Bitin对照点均为阳性。75例样本共28例阳性,其中单一

5、感染21例,复合感染7例。HPV单一感染时,在膜芯片上相应HPV亚型探针位点处可见一蓝紫色斑点,双重或多重感染时,在膜上可见两个或两个以上显色斑点(图1)。2.2荧光定量PR检测75例样本共检出25例阳性,其中单一HPV6/11亚型阳性15例,单一HPV16亚型阳性3例,单一HPV18亚型阳性2例,HPV6/11和HPV16均阳性1例,HPV6/11和HPV18均阳性4例。2.3Hybrax法与荧光定量PR比拟75例标本Hybrax法28例阳性,荧光定量PR25例阳性,经统计分析显示其差异无统计学意义(P0.05),说明二者在阳性结果中有较好的一致性,但实时荧光PR有一定的漏检率,漏检标本包括

6、2例53亚型及58亚型的单一感染和1例35和58亚型的复合感染。另外4例复合型感染除了有常见的6，11，16，18亚型外,还检出31，53,58,66及P8304亚型(表1,2)。在以上检测到的亚型中33，58，66亚型都为HPV的高危亚型,说明Hybrax法在检测HPV复合感染以及高危型HPV检出方面具有优势。3讨论宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,临床证明95.099.7宫颈癌和高危型HPV感染有关3。而且不同亚型HPV对子宫颈癌致癌性有不同影响,因此,准确诊断HPV感染及其分型对宫颈癌筛查、早期确诊及治疗效果监测有着重大意义。HPV分型检测研究一直受到国内外学者的高度重视4。目前,对HPV

7、感染的分型诊断主要方法有斑点杂交、Suthern印迹及实时荧光PR等。传统的斑点杂交、Suthern印迹由于杂交过程操作复杂,耗时长(杂交需十几个小时甚至1d),检测低拷贝基因的敏感性缺乏,可能需要使用同位素等,表1基因芯片结果与荧光定量PR结果的比拟:由于匹基实时荧光PR的试剂不能对HPV6和11两种亚型分别进展检测,因此,当患者感染其中任何一种亚型时,其检测结果表示为HPV6/11亚型阳性.表2荧光定量PR和基因芯片结果的2检验不合适临床常规检测。实时荧光PR检测HPVDNA已经应用于临床,其灵敏度和可靠性已得到认可,但目前能检测的HPV亚型非常有限,主要包括常见的HPV6,11,16,1

8、8四种亚型5,易漏诊其他HPV亚型的感染,不利于流行病学和病因学的进一步深化研究。基因芯片是近年来开展起来的可对病原体核酸进展高通量快速检测的技术6。Hybrax法是导流杂交技术结合低密度基因芯片技术,利用PR扩增进步检测的灵敏度,分子杂交特异性高,是HPV基因型分型检测的新方法7。运用其高通量检测的特点,到达对21种常见高危型和低危型HPV亚型在同一样品中进展分型检测。与现有的实时荧光PR相比,具有很多优点:(1)利用芯片高通量的特点可一次性检测21种亚型,增加了HPV感染的检出率及不同亚型复合感染的检测率3,尤其是高危型的检出；(2)芯片设计考虑了中国人感染HPV的特点,包含了中国人常见的

9、3个亚型(53，66和P8304亚型),有利于在我国筛查HPV感染；(3)有良好的质量控制体系。基因芯片上包括了阴性对照点、内对照点和bitin对照点,对基因扩增和杂交实行了全程控制；(4)整个检测过程仅需3.5h就可出具检验报告,检测时间短,能满足临床需要；(5)结果可靠。本实验通过与实时荧光PR的结果比照,说明Hybrax法的检测结果具有与荧光定量PR相当的灵敏度和可靠性。本研究中,Hybrax法共检出10种HPV基因型,其中高危型的检出率为18.7,混合型9.3；而实时荧光PR技术检出高危型13.3,混合型6.7。Hybrax法检出的高危型别包括HPV16，18，31，35，53，58，66型,其中HPV16，18型与泌尿生殖道肿瘤关系亲密,尤其是宫颈癌。所以对锋利湿疣患者进展HPVDNA的基因分型,对于断定预后,指导临床对高危型及多重型HPV感染患者长期随访,采取针对治疗措施,降低与HPV相关肿瘤的发生率