考试生化实验原理gcms

1、1气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术熊 英2013年12月20日2GC-MS基本原理GC-MS应用3 Agilent 气质联用仪4 GC-MS联用技术特点气相色谱法定性依据是色谱峰的保留时间，定量依据则是色谱峰高或峰面积。作为定性和定量方法，气相色谱法最大特点在于高效的分离能力和高的灵敏度，是分离混合物的有效手段。质谱法是依据带电粒子在磁场或电场中的运动规律，按其质荷比（质量和电荷的比）实现分离分析，测定离子质量及其强度分布。主要特点是能给出化合物的分子量、元素组成、经验式及分子结构信息，具有定性专属性强、灵敏度高、检测快速的优势。5色谱图上的信息61. 根据色谱峰的个数，可判断样品所含的最

2、少组份数。2. 根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析。3. 根据色谱峰的面积或峰高, 可以进行定量分析。4. 色谱峰的保留值及其区域宽度是评价色谱柱分离效能的依据。7色谱相关术语基线死时间/体积 tM/VM保留时间/体积 tR/VR调整保留时间/体积 tR/VR标准偏差 半峰宽 W1/2基线宽度 Wb8M+(M-R2)+(M-R3)+Mass Spectrum(M-R1)+质谱图上的信息abundancem/z9气相色谱-质谱谱图abundancetimem/z10气相色谱-质谱谱图11GC工作过程气相色谱工作流程图12检测系统1. 热导池检测器 (TCD)（浓度型、通用型检测器）2. 氢火焰

3、离子化检测器 (FID)（质量型、有机化合物）3. 电子捕获检测器 (ECD)（卤素化合物）4. 火焰光度检测器 (FPD)（含硫、含氮和含磷化合物）5. 氮磷检测器（NPD）（质量型、含氮和含磷化合物）6. 质谱检测器（质量型、通用型检测器）13灵敏度比较HP 5970 MSD与气相色谱常用检测器灵敏度比较（由惠普公司于1983年公布）14色谱基本原理 色谱法是利用混合物不同组分在固定相和流动相中分配系数(或吸附系数、渗透性等)的差异，使不同组分在作相对运动的两相中进行反复分配，实现分离的分析方法。15色谱法的分类气相色谱 (GC)超临界流体色谱 (SFC)根据流动相的物态可分为液相色谱 (

4、LC)16载气系统进样系统分离系统检测和记录系统温控系统17分离系统(色谱柱)色谱柱填充柱毛细管柱柱内径1-10 mm0.05-0.5 mm柱长度 0.5-10 m10-150 m总塔板数103 106样品容量 10-1000 0.1-50色谱柱是色谱分离的心脏！填充柱开管柱（毛细管柱）18毛细管柱分类壁涂开管柱（WCOT）载体涂渍开管柱（SCOT）多孔层开管柱（PLOT）固定相组成： 载体+固定液19对载体的要求具有多孔性，即比表面积大。化学惰性，表面没有活性，有较好的浸润性。热稳定性好。有一定的机械强度，使固定相在制备和填充过程中不易粉碎。20固定液高沸点的有机化合物热稳定性好，在操作温度

5、下不发生聚合、分解等反应；具有较低的蒸气压，以免流失。化学稳定性好，不与样品或载气发生不可逆的化学反应。粘度和凝固点低，以便在载体表面能均匀分布。对样品中的各组分有适当的溶解度。 对固定液的要求：21固定液的选择原则“相似相溶”a. 非极性物质非极性固定液。 沸点越低的组分越早出峰。b. 极性物质极性固定液。 极性越小的组分出越早出峰。c. 极性与非极性混合物极性固定液。 极性越小的组分出越早出峰。d. 易形成氢键物质极性或氢键型固定液。 不易形成氢键的组分先出峰，易形成氢键的组分后出峰。e. 复杂难分离样品多种固定液混合。22常用毛细管色谱柱固定液固定液极性大小适用范围100二甲基聚硅氧烷非

6、极性脂肪烃化合物，石化产品(50三氟丙基)甲基聚硅氧烷中等极性极性化合物，如高级脂肪酸聚乙二醇中强极性极性化合物，如醇、羧酸酯等23常见柱流失离子碎片 柱型 离子碎片m/z SE-54，HP-1，HP-5，OV-101 73、147、207、221、253、281、 327、355 OV-17，HP-17， 73、147、197、221、253、281、 327、355 OV-225，HP-225 73、135、156、197、253、269、 313、327、403 FFAB，HP-INNOWax，HP-FFAP 57、69、97、123、173、191、207、 219、240、264、2

7、89、305 聚乙二醇 131、133、147、161、163、191、195 205207、281、355 、24柱子老化的目的可提高1/3塔板数除去涂固定液时残留的溶剂除去交联不全或聚合度低的小分子化合物使固定液均匀铺展，掩盖某些活性点对于旧柱子，除去残留物25老化柱子的方法分段老化法 从较低温度开始，在不同温度段（150，200，250，300度）分别停留一段时间。注意不能长时间停留在高温下老化。程序升温老化法 一般从50-60度开始以10度/min升温至300度（依柱的最高使用温度而定）。进样老化法 老化一定要充足载气避免干烤柱子，但也有不同载气的特殊老化法。26GC-MS对载气选择的

8、要求必须是化学惰性的必须不干扰质谱图必须不干扰总离子流的检测应具有使载气气流中的样品富集的某种特性载气系统常用载气：氮气、氦气、氢气等27进样系统注射器气化室进样系统进样器气化室温度比柱温高出307028Column Flow1 mL/minSplit Vent Flow46 mL/min(Septum) Purge Vent Flow3 mL/minTotal Flow50 mL/min注射针SampleColumn Flow1 mL/min(Septum) Purge Vent Flow3 mL/min不分流进样Split Vent Flow0 mL/minTotal Flow4 mL/m

9、in注射针Sample分流进样29进样口、色谱柱、检测器的温度设定进样口温度考虑样品中各组分的沸点，设定温度使样品瞬间汽化。色谱柱温度考虑样品中各组分的沸点，及希望的分析周期，宽沸程样品应使用程序升温。检测器温度防止检测器污染，一般比色谱柱温度高20-30。DET.TINJ.TCOL.T+2030GC-MS基本流路图出口高真空泵机械泵气相化学工作站软件（电脑）质量分析器检测器质谱传输线离子源31提供足够的平均自由程提供无碰撞的离子轨道减少离子-分子反应减少背景干扰延长灯丝寿命消除放电增加灵敏度 为什么MS需要真空？32色谱-质谱接口直接导入型 内径在0.25至0.32 mm的毛细管色谱柱的载气

10、流量在12 mLmin。这些柱通过一根金属毛细管直接引入质谱仪的离子源。这种接口方式是迄今为止最常用的一种技术。毛细管柱沿图中箭头方向插入，直至有12 mm的色谱柱伸出该金属毛细管。载气和待测物一起从气相色谱柱流出立即进入离子源的作用场。接口的实际作用是支撑插入端毛细管，使其准确定位。另一个作用是保持温度，使色谱柱流出物始终不产生冷凝。 使用于这种接口的载气限于氦气或氢气。当气相色谱仪出口的载气流量高于2 mlmin时，质谱仪的检测灵敏度会下降。接口组件结构简单，容易维护。传输率达100，这种联接方法一般都使质谱仪接口紧靠气相色谱仪的侧面。这种接口应用较为广泛。33离子源电子轰击电离源（EI）

11、化学电离源（CI）场致电离源（FI）大气压化学电离源（APCI）电喷雾电离源（ESI）离子源的作用是将被分析的样品分子电离成带电的离子，并使这些离子在离子光学系统的作用下，会聚成有一定几何形状和一定能量的离子束，然后进入质量分析器被分离。34EI源电离过程灯丝发射电子，经聚焦并在磁场作用下穿过离子化室到达收集极。此时进入离子化室的样品分子在一定能量电子的作用下发生电离，离子被聚焦、加速聚焦成离子束进入质量分析器。EI的电离效率与电离能量有关，电离能量低于50eV时，离子产率随着电离能量增加较快，接近70eV时，增加渐缓趋于稳定，以后离子能量再增加，离子产率几乎不变。35电子轰击电离又称为电子轰

12、击，或电子电离。是应用最普遍，发展最成熟的电离方法。轰击电压 50-70 eV, 有机分子的电离电位一般为7-15 eV。可提供丰富的结构信息。有些化合物的分子离子不出现或很弱。Electron Impact Ionization（EI）M+(M-R2)+(M-R3)+Mass Spectrum(M-R1)+m/zintensity36EI源的特点结构简单、温控和操作均较方便电离效率高、所形成的离子动能分散小性能稳定、所得谱图是特征的、能表征组分的分子结构（目前大量的有机物标准质谱图均是用EI源得到的）37EI源的缺点样品必能气化，不适于难挥发、热不稳定的样品有的化合物在EI方式下分子离子不稳

13、定易碎裂，得不到分子量信息，谱图复杂解释有一定困难EI方式只检测正离子，不检测负离子38离子室内的反应气（甲烷等；10100Pa，样品的103105倍），受电子（100240eV）轰击，产生离子，再与试样分离碰撞，产生准分子离子。+气体分子试样分子+准分子离子电子(M+1)+;(M+17) +;(M+29) +;Chemical Ionization（CI）39小分子如 CH4 , (CH3)2CH 等。 以CH4为例CH4 + e CH4+ + 2e (46%) CH3+ (39%) CH2+(7%)初级离子: CH4+, CH3+ , CH2+CH4+ + CH4 CH5+ + CH3 (

14、48%)CH3+ + CH4 C2H5+ + H2 (41%) CH2+ + 2CH4 C3H5+ + 2H2 (6%) CH5+, C2H5+ , C3H5+ 等为稳定的次级离子。Chemical Ionization（CI）准分子离子：M+H+ M + CH5+ MH + + CH4 M + C2H5+ MH + + C2H4 40CI源的优缺点谱图重现性差，故谱库中无CI源标准谱图。和EI一样要求样品必须能气化，适用于热稳定性好、蒸汽压高的样品，不适于难挥发、热不稳定的样品。离子-分子反应后剩余的内能很小，故分子离子峰大，碎片离子峰少，谱图简单，易识别。CI有选择性，使其仅与样品中的被测

15、组分反应。可检测负离子，灵敏度高。41四级杆质量分析器42四极杆质量分析器是GC/MS联用中最通用的一种质量分析器，有长久的应用历史，性能稳定。有全扫描（Scan）和选择离子监测（SIM）两种不同扫描模式。扫描速度快，灵敏度高。尤其是SIM模式，以最大的采集效率，有选择性地检测单个或几个质量离子，从而降低信噪比，提高灵敏度几个数量级，适用于各种定量分析，满足高通量分析需求可同时配置EI和正、负CI源，EI源可获得丰富的结构信息，CI源则提供EI源得不到的分子量信息。43数据采集模式扫描（ Scan ）定性定量选择离子（SIM ）控制质量分析器，仅仅对感兴趣的质量进行分析44全扫描和选择离子检测

16、比较三聚氰胺标准品全扫描三聚氰胺标准品选择离子检测m/z 34245NIST谱库检索46谱图识别三聚氰胺标准品tR=16.5 minm/z 99, 171, 327, 34247谱图识别蒙牛饮用奶选择离子检测m/z 99, 171, 327, 34248谱图识别蒙牛饮用奶, 选择离子检测m/z 99, 171, 327, 342tR=16.5 min49稳定可挥发碎片涵盖质量范围宽仅有C-13 和 N-15同位素无质量缺陷全氟三丁胺(PFTBA)调谐标样50自动调谐报告 相近的峰宽平滑对称的峰形适当的EM电压合适的丰度值正确的质量分配典型的相对丰度合适的同位素比例51定量方法面积归一化法校正面

17、积归一化法外标法内标法52定量方法（一）面积百分率法（面积归一）各组分浓度以面积百分率表示，该结果可以确认大概的浓度，但有误差。校正面积百分率法（校正面积归一）用重量响应因子对峰面积进行修正，用该法测定的浓度比前者准确，但前提是样品中所有组分都出峰，否则也有误差存在。这两种方法应用的必须条件是： 1.样品中所有组分都出峰； 2.所有峰面积计算必须准确。53面积归一化法公式：优点：1）无需做校正，简便，快速2）进样量不严格要求缺点：1）所有组分都流出且被检测到2）所有组分的检测灵敏度都相同54校正面积归一化法公式：式中：Fi为校正因子， Fi浓度（含量）/面积用重量响应因子对峰面积进行修正，用该

18、法测定的浓度比前者准确，但前提是样品中所有组分都出峰，否则也有误差存在。优点： 进样量要求不严格缺点：1）所有组分都流出且被检测到2）所有组分都需作校正553.外标法该法是应用最广泛的方法之一，其误差来源主要是进样误差，因此，分析前一定要做面积重复性（即进样重复性）实验。4.内标法在样品中添加内标物，通过组分与内标峰的面积比，对组分进行定量。该方法减小了进样误差对定量结果的影响。定量方法（二）56内标物的选择内标物的峰与试样中的所有成分的峰完全分离。内标物的峰与目标成分的峰保留时间不应差太远。内标物具有与分析目标成分类似的化学性质。57外标法公式：优点：1）不需所有峰都流出或被检测到2）只对所

19、测组分作校正缺点：1）进样量必须准确2）仪器必须有良好的稳定性58内标法公式：优点：1）进样量不严格要求2）只对所测组分作校正缺点：1）必须在样品中加一内标组分2）操作较为繁琐3）选择内标物困难59GC-MS联用中常用的衍生化方法硅烷化衍生化 （羟基，羧基，胺基）（1）BSTFA和BTA衍生化胺基和羟基（2）MTBSTFA常用于药物、类固醇类检测（3）MSTFA是最常用的硅烷化试剂酰化衍生化（胺基和羟基）（1）乙酰化（2）三氟乙酰化/五氟丙酰化/七氟丁酰化烷基化衍生化（羧基）60RX HY Si R1+RX Si R1R2R3R2R3硅烷化衍生化 酰化衍生化R COOHR OH/I/N2+R

20、COOR烷基化衍生化R OHR NH2Y C R+R O C RR N C ROOHO+OHOR61GC-MS联用中衍生化的作用改善了待测物气相色谱性质改善了待测物的热稳定性改变了待测物的分子质量改善了待测物的质谱行为引入卤素原子或吸电子基团通过一些特殊的衍生化方法，可以拆分一些难分离的手性化合物62衍生化方法不当引起的弊端柱上衍生化有时会损害色谱柱某些衍生化试剂需在氮气流中吹干除去，方法不当会有损失衍生化反应不完全，会影响灵敏度衍生化试剂选用不当，会使待测物分子量增加过多，接近或超过一些小型质谱检测器的质量范围63衍生化方法不当实例茉莉酸甲基化茉莉酸硅烷化64分析方法的建立选择分析系统: 进样方式、色谱柱等GC参数: 载气流量、分流比、温度条件等MS参数: 扫描模式：SCAN, SIM 离子源： EI, PCI, NCI 检测器电压等65GC-MS应用MSD不但可用于未知物的鉴定，还可用于痕量组分的定量，所以应用面比一般气相色谱检测器广得多。MSD已广泛应用与环境、农业、食品、生物、医药、法庭和工业等诸多科学领域。66环境分析大气污染分析（有毒有害气