cisbio相关gpcr total solutionG蛋白偶联受体GPCR介绍

1、目录前言02G蛋白偶联受体（GPCR）介绍03均相时间分辨荧光（HTRF）技术06细胞水平检测HTRF c10HTRF IP-One细胞水平检测16CellulerkERK1/2磷酸化测量试剂盒20Tag-lite 技术原理23活细胞表面受体配体结合分析25活细胞表面受体二聚化/寡聚化分析29目 录Cisbio的研发，位于法国南部风景优美的Bagnolr creCisbio生物检测公司位于法国南部的Bagnol进人类健康事业的发展，包括医疗、临床r cre，是拥有50多年历史的创新公司，致力于促和药物研发等。利用在免疫检测领域的优势，结合Professor Jean-Marie Lehn在稀土

2、元素荧光特性方面的贡献，发明了稳定可靠、灵敏特异、操作简单的HTRF技术。HTRF技术利用稀土元素和普通荧光在生命周期上的巨大差异，在检测时采用时间延迟，去除了普通荧光的干扰，可最大程度上降低假阳性/假的发生，因而被各大公司应用到药物研发过程。世界前50位的公司都是的主要客户。HTRF技术全称为均相时间分辨荧光技术，应用非常广泛，包括免疫检测、激酶检测、蛋白质修饰（如磷酸化、泛素化、甲基化）、分子相互作用（如蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA）等。GPCR是现代药物研发中应用最多的靶点，在这方面，可以提供从细胞表面的受体分析、到细胞内第二信使检测、以及信号传导终端蛋白质磷酸化检测的

3、完整解决方案。提供最高质量的产品是的使命，的产品有效期至少为三年。确保产品以最短的时间到达客户手中是追求的目标，建立了库存，范围所有的常用产品都可在一周内送达。与此同时，提供最高质量的技术支持，与客户一起解决实验中遇到的各种问题，缩短建立实验模型（Assay Development）的时间，保持与客户的良性沟通。这本册子包括了HTRF技术在GPCR领域的大部分应用，如果有任何问题，可以直接与我本人联系，也可发信到htrf.多谢您长期以来对。的关注和支持！Cisbio亚太区总监谢 兵2010.11PAGE02前 言前 言PAGE03GPCR介绍GPCR介绍G蛋白偶联受体（GPCR）是一个庞大且功

4、能多样的膜蛋白 ，参与到大多数的细胞和生理过程的调节，包括视觉、嗅觉、代谢、免疫反应、神经活动等等，并与肥胖、心 疾病、炎症、肿瘤、老年痴呆症等严重影响人类健康的疾病有关，因而是现代药物研发中应用最多的靶点。市场上40%的处方药其靶点是GPCR，而销量最好的药也大多数是以GPCR为靶点开发出来的。GPCR由七个横跨细胞膜的Al a螺旋结构组成，包括胞外、跨膜、胞内三个部分。N-端在细胞外，C-端在细胞内，胞 分在非激活状态下与G蛋白偶联在一起，所以称之为G蛋白偶联受体。由于GPCR跨膜七次，所以也称为seven transmembrame receptor，7TM receptor。GPCR有

5、不同的分类方法，从结构上，GPCR可分为六个 ：A、B、C、D、E、F，它们之间在结构上没有相似性。A 是最大的 ，大多数GPCR属于这个 ，它们的第三个跨膜结构域胞 分有高度保守的DRY序列，即天冬氨酸-精氨酸-酪氨酸序列。B 的配体包括分子量较大的激素，例如糖原、 活性肠肽（VIP）等。C 的N-端非常长，并有Venus fly-trap样结构，类似于细菌的胞质结合蛋白（PBPs），成员包括GABAB受体、亲代谢型谷氨酸受体（mGluRs）等。其它三个 都比较小，每个 仅包括几个成员。图1是前三个 的示意图。图1：GPCR A、B、C分类和结构示意图这三个也称为1、2、3。1又分为a、b、

6、c三类。源自于Jol Bockaert, Encyclopedia of Life Scien, 2009Family 3Glutamate (metabotropic) Ca2+GABA (GABAB)eromones(VR,N)COOHFamily 2NH2Calcitonin-latrotoxin Secretin PTHVIP PACAP GnRHCOOHCRFFamily 1NH2RetinalSSOdorantsCatecholamines1aAdenosineATP, OpiatesDEnke alinsR YAnandamide COOHNH2PeptidesSSCytokin

7、esIl81bFormyl Met-Leu- e(fMLP)-peptideDPAF-acetherR YThrombinCOOHNH2SSGlycoproteins1chormones(LH, TSH, FSH)DR YCOOHP PDF NP PDF NP PDF N一般认为GPCR介导的信号通路由四部分组成：G蛋白偶联受体（GPCR）、G蛋白、第二信使和效应分子。G蛋白全称是GTP结合蛋白，与GPCR偶联，可结合GTP，促使细胞生成第二信使。G蛋白由、三个亚基组成，生理条件下紧密结合在一起，在多数G蛋白中都非常相似，而亚基差别很大。通常所说的Gi、Gs、Gq等就是根据亚基的不同所做的分类

8、。第二信使包括环腺苷酸（c）、环鸟苷酸（cGMP）、三磷酸肌醇（IP3）、二酰甘油（DAG）、Ca2+等，位于胞内，将信号传递到效应分子。大多数效应分子是各种酶类，主要是激酶。这四部分的示意图请见图2。Amino acids - amines Nucleotides - nucleosides ProstaglandinsPAFOdorants eromonesSmall endogenous moleculesCa2+TSH LH FSHerleukin WinglessProteinsNH2otone 3e 2VIVVII eOut1IIIIIVIIIni2iG D P1Second me

9、ssengersi3COOH图2：GPCR介导的信号通路的基本组成。源自于Jol Bockaert, Encyclopedia of Life Scien, 2009G蛋白偶联受体活化后，引起亚基上的GDP-GTP交换，GDP从亚基上解离，GTP结合上去而使其活化，并与亚基分离，继而细胞内第二信使水平发生改变。Gs和Gi介导的信号通路第二信使为c，其引起腺苷酸环化酶的激活或抑制，使细胞内的c增多或减少，将信号传递到下游的效应分子。Gq介导的信号通路活化后激活磷脂酶C，引起细胞内IP3浓度一过性升高，内质网钙通道开放，胞浆Ca2+浓度升高。还有由G12/13介导的第三个信号通路，通过Rho鸟嘌呤

10、交换因子（RhoGEFs），别构激活胞浆小GTP酶Rho。一般说的信号通路是指Gs/Gi和Gq通路。PAGE04G proteinEffectorReceptorenzymechannelGPCR介绍GPCR的研究和分析，可从两个角度进行：一为细胞膜表面的受体分析，包括受体配体结合分析、受体二聚化/寡聚化/内吞分析等；另一方面是细胞内功能性分析，包括Gs/Gi通路的c分析，Gq通路的钙流、IP3/IP1分析等。有不同的技术和方法进行GPCR研究。Cisbio利用高灵敏度、高稳定性的HTRF技术，提供GPCR研究的完整解决方案，包括活细胞表面的受体分析和细胞内基于第二信使的功能性分析见图3。除此

11、之外，ERK1/2作为GPCR信号通路的会聚点，被用作通用的GPCR活化的感应器。Cisbio开发了基于细胞水平的Cellulerk，直接检测细胞裂解液里的磷酸化ERK含量，大大简化了ERK的分析过程，并使高通量筛选成为可能。Ligand binding assaysGPCR dimersstudiesReceptor assaysFunctional assayscIP-OneERK图3：HTRF技术的GPCR研究完整解决方案PAGE05GPCR介绍HTRF 技术介绍快速、稳定、不需洗涤、操作简单、易于自动化和微型化。上述优势使得Cisbio的HTRF技术一直是药物研发领域的领先技术之一。该

12、技术已经在知名上。公司、生物技术公司和学术研究机构应用了20年以HTRF（均相时间分辨荧光，Homogeneous Time-Resolved Fluorescence ）是用来检测纯液相体系中待测物的一种常用方法，是研究药物靶标的理想。该技术结合了荧光能量转移（ FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer）和时间分辨荧光（TRF, Time-Resolved Fluorescence)）两种技术。这种结合将TRF的低背景特点和FRET的均相实验方式融合在一起，使得HTRF技术拥有如下优势：实验方式灵活、可Eu3+ Crype靠，并且具有更高的灵敏度

13、、更大的通量，实验结果的假阳性率较低。虽然 HTRF也是基于TR-FRET的化学技术，但它的许多特点把它与其它TR-FRET产品区分开来。这些特点包括使用了镧系元素（铕和铽），从而具有非常长的半衰期，很大的Strokes shift（如图1所示，Eu3+ Strokes shift 300 nm）；同时，镧系元素与络合的穴相结合，这种结合的穴状物与其它所有TR-FRET产品使用的螯合物相比，显著增加了稳定性（可耐受低 值、金属离子、DMSO、EDTA等）；专利的比值测量能矫正淬灭和样品带来的干扰。Exciion SpectrumEmisSpectrum550600650700Wavelengt

14、h nm200300400Wavelength nm图1:Eu3+穴状化合物的光谱FRET 技术简介FRET技术利用了两种荧光基团的能量转移，这两种荧光基团分别称为（能量）供体和（能量）受体。供体被外来能源激发（例如闪光灯或激光），如果它与受体在足够近的距离之内，可以将能量移到受体上。受体受到激发，发出特定波长的发射光。转将供体和受体分别与相互作用的两个生物分子结合，生物分子的结合可以将受体和供体拉到足够近的距离，产生能量转移。由于受体分子的发射光来自于能量转移，所以在实验中不需要将未结合与已结合的分子分开，即不需要洗涤步骤。这种均相的实验方式操作简单，而且减少了实验时间和花费。一般地，在FR

15、ET实验中使用的供体和受体是快速荧光基团，半衰期非常短。传统FRET技术的限制是由背景荧光引起的，其来自于样品成分，包括缓冲液、蛋白质、化合物和细胞裂解液。检测到的荧光强度必须对这些自发荧光进行校正，极大地影响了实验灵敏度，并使数据分析变得复杂。背景荧光非常短暂（为纳秒级），可以利用时间分辨荧光方法将其去除。PAGE06ensityensityHTRF 技术介绍TRF 技术简介如前所述，在生物溶液或中的很多化合物和蛋白质是自发荧光的，利用传统的快速荧光基团进行检测极大限制了实验灵敏度。使用长的荧光基团结合时间分辨的检测方式（在荧光激发和发射检测之间有一个时间延迟）可将快速荧光的干扰降到最低，如

16、图2。图2: 时间分辨荧光技术原理时间分辨荧光（TRF）利用稀土元素中镧系元素的独特性质。在TRF中常用的镧系元素是钐（Sm）、铕（Eu）、铽（Tb）和镝（Dy）。与传统荧光基团相比，它们具有大的Stokes shifts和非常长的发射半衰期（从微秒到毫秒），这使它们在生物学荧光应用领域益重要。通过直接激发使镧系元素离子产生荧光是不容易的，因为这些离子很难吸收光子。镧系元素必须首先与有机分子形成复合物，有机分子收集光子并通过分子放射过程转移到镧系元素上。稀土元素螯合物和穴状化合物是能量收集装置的典型代表，它们收集能量并转移到镧系元素离子上，后者则发出其特征性的长的荧光。为了能够成功应用于生物学

17、检测中，稀土元素复合物应该具有特定的性质，包括稳定性、较高的发射光产率，并且能够与生物分子连接。除此之外，当直接在生物溶液中反应时，能够耐受荧光淬灭就显得尤为重要。稀土元素螯合物稳定性较差，而且有的化合物可竞争螯合物活性基团，当与FRET技术结合在一起时其灵敏度也受到限制。如果稀土元素与穴状化合物结合，许多限制都可去除。HTRF技术的能量供体（Donor）和能量受体（Acceptor）HTRF的供体是铕穴状化合物（Eu3+cryp e）或Lumi4 铽穴状化合物（Tb2+ cryp e），后者是近年与 Lumi ore公司合作的结果，激发效率更高。两者的能量受体（Acceptor）均可为XL6

18、65和d2。XL665和 d2激发波长为620nm，发射波长为665nm，位于红外光区，进一步降低了生物溶液对实验的影响（生物学成分很少在红外光区有自发荧光）。对于铽穴状化合物来说，其受体也可以是Fluorescin、GFP等发绿色荧光的分子，所以可以进行双标记测量。XL665是改良过的别藻蓝蛋白（APC），将APC的亚基偶联，增加了稳定性。d2是第二代受体，光谱学特征与XL665相同，但是分子量较小，约为1KD，可减少空间位阻对实验的影响。PAGE07HTRF 技术介绍当由于生物分子相互作用导致两个荧光基团接近时，在激发时被穴状化合物捕获的部分能量，发射波长为620nm；另一部分能量转移到X

19、L665或d2，发射波长为665nm。665nm的发射光仅仅由donor引起的FRET产生。所以，当生物分子相互作用时，有两个激发光620nm和665nm；当不存在相互作用时，只有620nm一个激发光（见图3）。图3 ：HTRF原理穴状化合物与螯合物穴状化合物的形成是将一个阳离子纳入到一个笼中，见图。笼能收集光然后将能量转移到的镧系元素。大环的性质有利于跟镧系元素紧密相连，这种不可破的连接会形成异常稳固的复合体。穴结构能耐受一些特殊的实验条件如大量存在的阳离子（ M g 2+ 和 M n 2+ 等 ） 、 螯 合 物 （ ED TA ）、溶剂或者温度。从HTRF 能应用到临床（TRACE技术和

20、Kryptor 工作站技术）就能看出 它 也 适 用 于 浓 度 高 的 （50%）。在读板前或者孵育时加入氟离子能增强实验对大量化合物的抗干扰性。穴没有光漂白性，多次读数后信号没有损失，因此能按照需要的次数去读，所以可以进行动力学检测。图4 ：穴状化合物的结构专利号：US Patent US 5,527,684由于在该结构上的贡献，Prof. J.M. Lehns在 1987年获得了奖。PAGE08HTRF 技术介绍HTRF技术的优势背景低，化合物和基的干扰小均相检测（不需要洗板），操作简单实验稳定，对酸性溶液、Mg2+、Mn2+、DMSO、EDTA比较耐受，并且读数稳定24小时以上，至可达

21、7天应用灵活多样易于实现微型化HTRF的应用HTRF技术被广泛应用于细胞实验和生化实验，并应用于药物研发的不同，从实验方法的建立、高通量筛选（HTS），lead到hit，到临床前研究。这是一种很灵敏且稳定的技术，可以使用384和1536板。自从10年前HTRF技术进入药物研发领域以来，研究者采用该技术加快了很多基于抗体的研究，包括GPCR（受体配体结合、受体二聚化、c和IP1的检测、以及磷酸化ERK的定量）、激酶、细胞因子和生物标物、生物过程（抗体和蛋白生产）等，以及蛋白和蛋白、蛋白和多肽、蛋白和DNA/RNA相互作用的实验。HTRF具有与ELISA同等的检测范围和检测极限，但是它不需要洗板，

22、可以极大地减少实验时间，所以HTRF技术可以代大部分ELISA实验，为均相ELISA。GPCR SolutioncP-One CellulerkReceptor-ligand bin ding GPCR dimerizationGPCRern alizationKinases and protein modificationsTyr, Thr & Ser Kinases Ubiquitination TransferasesProtein:proteinS 6 dimerizationCD28 / CD86Immunoassays & Antibody screeningHuman IgGsl

23、ight chainsHIV-RT / HuRb-catenin / h T-Cell Factor.Nucleic acid related assaysPARP activity omeraseNuclease Topoisomerase Helicase.Proteases Caspase 3 HSV protease BACE.EndoglycosidasesHeparanasePAGEReceptorsDimerization in native ties EPO-R, EGF-RVEGF-R, uPARPPAR .09HTRF 技术介绍HTRF cc简介1957年，(DUO 6XW

24、KHUODQG发现了c（腺苷-3,5-环化一磷酸），并且在1971年获得了奖。c和腺苷酸环化酶的发现，导致跨膜信号和激素调的细胞内第二信使等的出现。c作为第二信使在信号转导方面发的作用。对于激型受体（Gs）来说，当细胞受到外界激时，胞外信号分子首先与受体结合形成复合体，然后激活细胞膜上的Gs-蛋白，被激活的Gs-蛋白激活细胞膜上的腺苷酸环化酶（AC），化ATP去一个磷酸而生成c。生成的 F$03作为第二信使通过激活PKA（c性蛋白激酶），使靶细白磷酸化，从而调节细胞反应，c最终又被磷酸二孆酶（PDE）水解成5-而失活。整个过程如图1所示。c生成和分解过程Mg2+的存在。AC和PDE可以从两个不

25、同方面调节细胞内c浓度，从而影响细胞、组、器的功能。当AC的活性升高时，c浓度升高，当PDE浓度增高时，c浓度降低。如果是抑制型受体（Gi），引起的反应是AC的抑制，c产生降低。BMX: 3-Isobutyl-1-Methylxanthine图1：F$03 的代谢过程可测定c的技术很多，例如时间分辨-荧光能量转移（TR-FRET）、荧光振、ELISA、Al aScreen、化学发光、化学发光、酶互技术（EFC）等等。Cisbio的HTRF是一个非常简 ，灵敏的方法，在世界范围内被各大制药业广泛应用。Cisbio有三种试剂盒可用于检测c，均采用了HTRF技术。而且每种试剂盒都对特定范围的c浓度，

26、从而确保了实验的灵敏度。所有试剂盒均可用于96、384或者1536的细胞水平的实验。PAGE10HTRF c适用于高通量筛选(HTS)的高效率的单板实验方案很低的假阳性和假结果稳定的EC50，持时间从实验体可缩小到10L以下新细胞或存细胞都能使用到7天应用Gs或Gi偶联受体激动剂和抗剂的筛选磷酸二孆酶(PDE)活性检测腺苷酸环化酶(AC)的活性僂GPCR同激动剂结合后会发生结构改变，从而活化腺苷酸环化酶（ AC ），进一步化ATP 生成F$03 同时c又在磷酸二孆酶（PDE）作用下进一步降解成$03 而IBMX可以抑制PDE的活性，c从而抑制c降解成。因此可以通过在实验中加入IBMX检测的c量

27、， 而c的量可&HOO /VLV +75) UHDJHQWV以直接反化合物对GPCR介导的AC是活化还是抑制。 QPFRET该试剂盒可直接对c定量，原理基于HTRF技 QP12 )5(7术的竞争法实验模式，见图2。细胞所产生的c QP和试剂盒所提供的标记了d2的c竞争抗cc -d2c -d2抗体的抗原结合位点。当标记了铕或铽的抗c抗体跟d2标记的c结合后，会发生能量转&USWDWH FRQMXJDWH移，产生比较大的信号。细胞内产生的c图2：HTRF F$03 检测原理增多，未结合d2的c 减小。与抗体结合增多，信号PAGE11HTRF c为了足各种自动化器操作，根据细胞激后的步骤，每个试剂盒

28、都提供了一步或两步加样方案，见图3、图4。,QFXEDWe PLQ,QFXEDWH KRXU图3：细胞激后一步加样操作步骤I Xabte PLQI Xabte KRXU图4：细胞激后两步加样操作步骤Cisbio提供的三组试剂盒了广泛的细胞水平的实验，见图5。图5：HTRF F$03三种试剂盒的性能比较PAGE12HTRF cF$03 IHPWR, 是最灵敏的c试剂盒，目前有铕和铽标记的两种。这两种试剂盒都能检测到 S0 F$03 IPROHV ZHOO LQ / YROXPH 因而可以用很低的细胞密度，低至 至 细胞/。F$03 GQDPLF 比较大的F$03 浓度检测范围，适合于大多数*L

29、V 实验。F$03 +L5DQJH 拥有很大的信比（Z0.9） 适合于+76 和用制的膜进行实验。僂能HTRF F$03 实验非常稳定，孵育时间延长，检测结果在7天时保持高度一致，见图6。&+2 . 细胞在 0 IRUVNROLQ (& 存在的下，用甲基组激。读数时间从1小时到7天。实验在384板里进行，体为 /。图6： +75) F$03实验结果稳定7天应用用c定受体用四种激动剂和一种抗剂分别作用于降钙素受体（Gs）。激动剂实验过程：将激动剂与细胞孵育30分，加入检测试剂孵育1小时后，读数。抗剂实验过程：将激动剂与抗剂以及细胞合孵育30分，加入检测试剂，1小时后读数。结果如图7所示：图7：用

30、c定人内源性降钙素受体四种激动剂和一种抗剂分别作用于降钙素受体（Gs），得到的EC50与献道一致。PAGE13HTRF c所有的产品都包括1,000、20,000、 WHVWV的包装，具体如下：产 品 号产品名称产品录样选合适的c检测试剂盒在基于细胞的检测实验中，细胞内c水平不仅于激动剂或抗剂，还于细胞本的性质。当选c试剂盒时，要从所使用的技术和细胞的生物学性质两方面去。技术需的灵敏度和精密度实验的信比工作范围，一般指介于IC20和IC80的c实验稳定性和Z较低的化合物干扰率浓度。在这个范围内，信号值与c浓度关系容易建立的实验方法操作步骤的简性PAGE1462AM5PEB62AM5PEC62A

31、M5PEJcIePto 1,000 tests20,000 tests100,000 tests62AM7PEB62AM7PEC62AM7PEJcAM3 IePto Tb1,000 tests20,000 tests100,000 tests62AM4PEB62AM4PEC62AM4PEJcAM3 GnaPLc 2 1,000 tests20,000 tests100,000 tests62AM6PEB62AM6PEC62AM6PEJcHiRange1,000 tests20,000 tests100,000 testsHTRF c的生物学下列会影响对c试剂盒的选：如果是重组细胞，受体表达水平

32、和偶联效率直接影响c水平测量Gi偶联受体的激水平变化时，需要实验能够检测到c的微小变化，同时得到较好的信比。进行抗剂实验也需要较好的灵敏度，因为也需要检测到c的微小变化细胞的最大细胞浓度也于微板检测的表面，这一点在高通量筛选（HTS）实验中经常成为一个限制在细胞水平的实验中，所有这些均直接影响了细胞内c水平和检测大小。对细胞内个特定浓度的c进行检测，检测决于实验灵敏度和信比，见图8、图9。用F$03 GQDPLF NLW试剂盒进行细胞水平的实验，标和期的检测之间的关系。第一个实验细胞产生了2 Q0 F$03，检测为标的最大检测范围的30%。在第二个实验中，c浓度达到了 Q0，检测为标的75%。

33、图8： 检测于细胞当细胞内c浓度是 Q0时，最大检测是标的比例：F$03 +L5DQJH NLW 是10%，F$03 GQDPLF NLW是 ，F$03IHPWR NLW是 。当然，也要到三种试剂盒的信比分别为：F$03 +L5DQJHNLW为41，F$03IHPWR NLW为10。GQDPLF NLW为18，F$03图9：三种c试剂盒的标比较PAGE15HTRF cHTRF IP-OneGq化量Gq简介G蛋白介导的信号转导通路主要有三种，通过G蛋白的四个亚型来介导：Gs、Gi、Gq和G12/13。Gs和Gi通路的效应分子为c，引起蛋白激酶A（PKA）的活化或抑制。G12/13通路的效应分子为

34、 Rho鸟嘌呤交换因子（RhoGEFs），能通过别构效应激活胞浆小GTP酶Rho。Gq通路的效应分子为磷脂酶& （3/&），引起细胞内Ca2+浓度升高（见图1）和钙调蛋白的活化。具体如下：细胞外的信号分子与Gq受体结合后，激活细胞膜上的磷脂酶 C，水解磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2）为肌醇 1,4,5-三磷酸（IP3）和二酰甘油（DAG）。IP3与面内质网和体上的受体结合，钙通道活化，引起细胞内钙离子浓度升高。DAG的作用是激活蛋白激酶C（PKC），引起许多蛋白的磷酸化。钙离子可与DAG一起活化PKC，并可激活钙-钙调蛋白激酶通路，引起炎症、代谢、平肌收缩、记、神经元生长等特定反应。IP3

35、和DAG介导的信号通路通过Ca2+-CaM联系在一起，钙流变化在Gq图1：*T 蛋白介导的信号传导通路介导的信号通路中起的作用。Gq通路活性的检测有两种，分别测定细胞内Ca2+浓度的变化和IP3含量的变化，前者主要通过荧光法来实现。后者中的IP3半衰期很短，不到30秒，其产生后在5磷酸酶的作用下很快生成IP2，然后生成 IP1，终产物为PR 肌醇。LiCl能够阻断由IP1到PR 肌醇的产生过程，所以如果细胞内加入一定浓度的 LiCl，可引起IP1的聚。通过测定IP1的含量，可以道细胞内IP3的产量，从而研究Gq通路的活化过程（见图2）。Cisbio基于HTRF技术的IP1测量试剂盒就是基于这一

36、原理研发出来的，是研究Gq通路的良好工具。目前该试剂盒被广泛应用于药物的高通量筛选。图2：,3 的产生及代谢过程PAGE16HTRF IP-One僂HTRF IP1测量试剂盒是基于HTRF技术的竞争性免疫检测，使用了铽穴状化合物（7E FUSWDWH）标记的抗IP1单抗和d2标记的IP1。细胞所产生的IP1和试剂盒所提供的标记了d2的 IP1竞争抗IP1抗体的抗原结合位点。当铽标记抗IP1抗体与d2标记的IP1结合后，会发生能量转移，产生比较大的信号。细胞内产生的IP1增多，游离的IP1与抗体结合增多，信号减小（见图3）。OHOHOHOHOPO 3 HOHIP1Cell Lysis + HTR

37、F reagentsFRETIP1IP1NO FRETd2d2IP1IP1基于细胞的功能性实验不需洗涤的简单方的实验方案稳定的实验结果（EC50从1小时到7天均保持稳定）理想的筛选，Z大于0.85可以微型化到 /体系图3：HTRF ,3 测量试剂盒实验原理应用Gq相关的受体活化缓结合和快速结合的激动剂均可检测（钙流只能测定快速激动剂）激动剂、抗剂、别构效应物以及激动剂僂整个实验过程非常简单，只需要将细胞好，加入化合物，加入HTRF试剂，检测即可，见图4。细胞可以用新的细胞，也可以用细胞。加入细胞加入化合物1-d2Anti-IP1-T%XIIHU 中含有LiCl读数温孵育1h37孵育 PLQ图4

38、：HTRF ,3 测量试剂盒实验流程图PAGE17HTRF IP-One能僂HTRF IP1测量试剂盒是验过的适用于Gq受体活化的检测方案。对一系列Gq受体和相关的配体，把HTRF IP1测量试剂盒与磷酸肌醇同位素测定方法和钙流检测方法进行了比较，EC50具有可比性，如图5所示。表1列出了部分IP1验过的受体及其与同位素方法的比较，从中以看出HTRF IP1检测方法可以代同位素法。可IC50 = 0 85 nM,& Q0,& Q0HTRF IP1 检测同位素方法检测所有的磷酸肌醇荧光法检测细胞内钙离子浓度图5：V1A与受体结合的浓度抑制从图5可以看出，HTRF ,3 方法、同位素方法、荧光测钙

39、流方法，其IC50分别为 Q0、 Q0和 Q0，基本一致。PAGE18检测灵敏度 Q0检测范围 Q0信比可达 EC50 Q0Z / 板)特点与 0 PRLQRVLWRO、PIP2、IP2、IP3、,3 或 3,3 没有交反应样品类型新或细胞均可062 耐受性5%HTRF IP-One1 *T受体动用HTRF 和定的EC50 ：采用细胞 其均为细胞产 品 号产 品 名 称产 品 PAGE1962IPB62IPC62IPJIP -One Tb Nit1,000 tests20,000 tests100,000 tests62IPATDAIP -One Tb control62IP1CDAIP -O

40、ne calibrator62IP1FDC62IP1FDGIP -One stiPXl. BXIIer 5X8 PL100 PL*3&5 细胞激动剂EC50HTRF 方法同位素方法0XVFDULQLF 0 *T CHO-K1$FHWOFKROLQH Q0 Q0Carbachol Q0 Q09DVRSUHVVLQ 9 $ *T CHO-K1Vasopressin Q0 Q0Vasopressin* Q0 Q02WRFLQ 27 *T CHO-K12WRFLQ Q0 Q0+LVWDPLQH + * CHO-K1$PWKDPLQH Q0 Q03XULQHUJLF 3 *T 1321N1 PHWKOW

41、KLR $3 Q0NDKROHFVWRNLQLQH &. *T 1321N1&. 6XOIDWH Q0 Q0KHPRNLQH &56 * CHO-K1RANTES Q0 Q00,3 Q0ND+XS&DU *T CHO-K1&DOFLXP Q0NDEndothelin Q0 Q0(QGRWKHOLQ (WE *T CHO-K1(QGRWKHOLQ Q0 Q0Ala-endothelin Q0 Q075+, *T *% *% *TL CHO-K1TRH Q0NDGABA Q0 Q0P*OX5 *T HEK2934XLVTXDODWH Q0 Q0P*OX5 *T HEK2934XLVTXDODWH

42、Q0 Q00XVFDULQLF 0 HEK293$FHWFKROLQH Q0ND3XQHUJLF 3 80%对于竞争性实验，标记配体的浓度 .G加入的标记配体的结合率 0.5Cisbio的Tag-liteTM技术将新出现的SNAP-Tag技术和经典的HTRF 技术结合起来，稳定可靠，是同位素方法的代解决方案。SNAP/CLIP物与HTRF 荧光反应形成生物，例如与铽穴状化合物（Lumi4 -Tb）形成生物，SANP-GPCR或CLIP-GPCR融合蛋白与其反应，形成标记了Tb的GPCR。然后，加入荧光标记的配体，Tb与配体上的荧光产生能量 转移，根据信号强来检测受体配体结合程度。僂构合的Tag

43、-liteTM将pSNAP或pCLIP质与目标GPCR的序列构建质。转入细胞后，该质可表达N端融合了SNAP或CLIP的GPCR，如图1。用Tag-liteTMGPCR受体体合4:僂 pSNAP-GPCR质: 用来时表达GPCR-SNAP或构建稳转细胞。SNAP对GPCR功能没有影响，可在细胞中进行功能性检测。Tag-liteTM SNAP-Lumi4-Tb物：将HTRF Tb穴状化合物标记到GPCR上。Tag-liteTM荧光标记配体:经过验的与GPCR结合的特异性配体，其上标记HTRF 受体（红色或绿色）。PAGE26Tag-liteTag-lite物Tag-liteTM体Tag-lite

44、物体GPCR-SNAPGPCR+SNAP合了Tb的GPCRGPCR与体合生HTRF图4：Tag-liteTM受体配体结合实验过程连接了HTRF 供体的GPCR与荧光标记的配体结合（该荧光是HTRF 的受体），产生HTRF 信号，即：两个特异性发射光谱，如图3 所示。STSTGPCR-SNAP-Tb体受体体合图3：受体配体结合实验SNAP和CLIP物可与HTRF 的供体（Donor）Tb穴状化合物结合。物与SNAP或CLIP反应后，HTRF的供体就与GPCR连接在一起。物也可与HTRF 的荧光受体结合（Acceptor）,形成标记了受体的 GPCR，用于其它应用，过程如图2所示。与Tb-物生物G

45、PCR-SNAP-Tb图2：细胞标记形成GPCR-SNAP-Tb受体体合应用D2受体体合僂进行了配体Kd值检测和受体配体竞争抑制实验，结果如图5、图6所示。构建SNAP与多D2受体的表达体，时转后，加入Tb标记的物，得到 GPCR- SNAP-Tb。然后，加入浓度升高的红色荧光标记的配体，检测HTRF 信号。本实验所得Kd = 15 8 nM。120,000100,00080,000Total Signal60,000Specific40,00020,00000 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100Dopamine D2 Receptor Red Antagonist

46、nM图5：多D2受体配体Kd测量实验50,000SNAP-多D2时转细胞后，标记Tb。然后，加入3nM红色荧光标记的NAPS (antagonist) - IC50=0.3nM P T (agonist) - IC50=16nM40,00030,000配体和NAPS/PT。测定的IC50分别20,000为：0.3 nM和16 nM。10,0000-13 -12 -11-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4Compound (logM)图6：多D2受体配体竞争抑制实验Tag-liteTM与的受 体 化 合 物 同位素方法（K）Tag-liteTM（K）GPCRCisbio供的含有SNAP的质

47、：提供含有信号肽的空质和转了受体含有CLIP的质：提供含有信号肽的空质和转了受体标记了Tb的物的质的质标记了Acceptor荧光的配体，荧光可以发绿光或者红光标记缓冲液PAGE27HTRF Ratio (665/620)HTRF Ratio (665/620)NAPS（抗剂）0.640.14多D2PT（激动剂）13.37.65受体体合 的 体GPCR受 体PAGE28L0001REDVasopressin receptors red antagonist #2 - 5,000 testsVasopressinV2L0002REDDopamine D2 receptor red antagoni

48、st - 5,000 testsDopamineD2L0003REDVasopressin receptors red antagonist - 5,000 testsVasopressinV1aL0004REDVPAC1 receptor red agonist - 5,000 testsVasoactive estinal Peptide VPAC1VPAC1L0005REDOpioid receptors red antagonist - 5,000 testsOpioidDelta, Kappa, MuL0006REDMelanocortin receptors red agonist

49、 - 5,000 testsMelanocortinM3C, MC4, MC5L0007REDAngiotensin receptors red agonist - 5,000 testsAngiotensinAT1,AT2L0008REDNK1 receptor red agonist - 5,000 testsTachykininNK1L0009REDNK2 receptor red agonist - 5000 testsTachykininNK2L0010REDAl a adrenergic receptor red antagonist - 5,000 testsAdrenergic

50、Al a1A, Al a 1B L0011GRE Beta2 adrenergic receptreen antago - 5000 testsAdrenergicBeta2L0012REDCXCR4 receptor red agonist - 5,000 testsChemokineCXCR4L0013REDCCK receptors red agonist - 5,000 testsCholecystokininCCK1,CCK2L0014REDGABAB receptor red antagonist - 5,000 testsGABABL0015GREHistamine H1 rec

51、eptreen inv ago -5,000 testsHistamineH1L0016REDBradykinin B1 receptor red antagonist - 5,000 testsBradykininB1L0017REDBradykinin B2 receptor red antagonist - 5,000 testsBradykininB2L0018REDGIP receptor red agonist - 5,000 testsGlucagonGIPL0019REDBombesin receptors red agonist - 5,000 testsBombesinBB

52、2L0020REDGhrelin 1A receptor red agonist - 5,000 testsGhrelinGHSR1AL0022REDEndothelin receptors red agonist - 5,000 testsEndothelinETA, ETBL0024REDChemokine CCL3 receptors red agonist - 5,000 testsChemokineCCR1L0025REDOrexin receptors red agonist - 5,000 testsOrexinOX1, OX2L0026REDUTR2 receptor red

53、agonist - 5,000 testsUrotensinUTR2L0027REDPRRP receptor red agonist - 5,000 testsProlactin-releasing peptide PRRPPRRPL0028REDNMU1 receptor red agonist - 5,000 testsNeuromedinU1L0030REDGLP1 receptor red agonist - 5,000 testsGlucagonGLP1L0038REDBombesin receptors red agonist #2 - 5,000 testsBombesinBB

54、1, BB3受体体合的体PAGE29受体化 化受体化 化G蛋白偶联受体很以来一直被认为是以单体的形式存在，并且与配体结合进行信号转导的。然而，近年来，来多的实验据表明，有的GPCR可通过形成同源二聚体或异源二聚体而发作用。虽然这种 在与G蛋白结合方面的作用还存在争，但是许多GPCR确实可形成二聚体/寡聚体是置的，尤其是C类受体（class C receptor）。二聚体/寡聚体除了可能参与G蛋白结合，还可能在GPCR敏、GPCR 后从内质网分到细胞表面等过程中发作用。二聚化/寡聚化的发现新药研发提供了新的路，尤其是对于异源 。在这种模式下，药物可能与一个GPCR结合，并共同活化了第二个GPCR

55、，引起细胞反应。如果 只用其中一个 GPCR去做筛选，很可能看不到有意的结果。同时，受体 的提出，受体（or an GPCR）也提出了新的解释。或许，这些受体可与其它GPCR形成二聚体/寡聚体，作为 parter，而不是以单体的形式发作用。有两个不同的方进行受体二聚化/寡聚化检测，一个是体外检测，一个是活细胞检测。CO-IP是应用最广泛的检测二聚化/寡聚化的体外方法。活细胞检测的方法主要基于能量 转移（RET）原理，包括FRET、pbFRET、BRET、HTRF （TR-FRET）等。Tag-liteTM将 SNAP-Tag、HaloTag和HTRF 技术结合起来，可以非常方可靠地检测活细胞受

56、体二聚化/寡聚化。体的构建SNAP和GPCR的共表达体，转入细胞后，可表达SNAP-GPCR的融合蛋白。然后，加入分别标记了Tb和Acceptor荧光的物，则部分GPCR标记了Tb（Tb-GPCR），部分标记了Acceptor荧光（AcceotPCR）。如果GPCR可以形成同源二聚体，配体激后，两个GPCR会相互靠近并偶联。Tb-GPCR与Accept振转移，检测到HTRF 信号，见图1。PCR之间发生能量共图1：GPCR同源二聚体检测模式体的分别构建SNAP-GPCR1和CLIP-GPCR2的表达体，共转，到表达SNAP-GPCR1和CLIP-GPCR2的细胞。加入标记了Tb的SNAP物和标

57、记了Acceptor荧光的CLIP物，细胞表面的受体为Tb-SNAP-GPCR1和Acceptor-CLIP-GPCR2。如果GPCR形成异源二聚体，配体激后，GPCR1/2相互靠近发作用。Tb与Acceptor之间发生能量测到HTRF 信号，见图2。转移，检HaloTag 与SNAP相似，也是一个自标记的酶，通过与标记了荧光图2：GPCR异源二聚体检测模式的物反应，将自标记上荧光。在这个实验中，HaloTag 与GPCR的表达体。也可以构建和优势活细胞水平的检测检测背景低：时间分辨荧光的检测方式，没有荧光自的交干扰和来自样品自发荧光的干扰实验结果可靠：HTRF 技术使检测结果反的是正的受体，

58、而不是仅仅相互靠近不需要抗体：Tag-liteTM利用的SNAP技术，不需要抗体来确定实验的特异性应用领域受体二聚化/寡聚化分析受体的研究PAGE30受体化 化应用CGPCR：GABAB1与GABAB2的化分别构建GABAB1与SNAP-Tag和GABAB2与HaloTag 的表达体，共转细白表达后，固定SNAP的物BG-Tb浓度不变，配制不同浓度的HaloTag 的物Halo-Red浓度，将两种物合后加入细胞。孵育1h后，检测HTRF 信号，实验结果如图3所示。图3：GABAB1与GABAB2的异源二聚化检测GABAB1与GABAB2形成异源二聚体发作用。Halo-Red浓度的加大，有上，H

59、TRF 信号增强，直到达到平。的能量从Tb转移到RedAGPCR：D2与Delta 的化分别构建Delta与SNAP-Tag和多与HaloTag 的表达体，共转细白表达后，固定SNAP的物BG-Tb浓度不变，配制不同浓度的HaloTag 的物Halo-Red，将两种物合后加入细胞。孵育1h后，检测HTRF 信号，实验结果如图4所示。图4：多D2与Delta 的异源二聚化检测多D2与Delta形成异源二聚体发作用。Halo-Red浓度的加大，有Red上，HTRF 信号增强，直到达到平。的能量从Tb转移到Cisbio供的含有SNAP的质含有CLIP的质含有HaloTag 的质标记了Tb的物标记了A

60、cceptor荧光的物，荧光可以发绿光或者红光标记缓冲液PAGE31受体化 化Tag-lite 名 Tag-liteTMStable Cell LinePAGE32C1SU1AT1Tag-lite AT1 stable cell line1,000,000 cellsC2SU1CCK1Tag-lite CCK1 stable cell line1,000,000 cellsC1SU1CCK2Tag-lite CCK2 stable cell line1,000,000 cellsC1SU1CXCR4Tag-lite CXCR4 stable cell line1,000,000 cellsC1