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文档简介

1、标记HRP-简易过碘酸钠法.原理：经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP残留的a -和e氨基基以避免酶分子之间的交联。后来 Wilson等改用在低PH下使NaIO氧化HRP从而省去 了二硝基氟苯封闭HR叫骤。HRPg NaIO,氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的 氨基相连，形成斯夫氏险，后者可进一步用NaBH (或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体试剂及器材0.1M NaIO:称取24.1mg高碘酸钠溶于1ml蒸储水中。1mM pH4.4醋酸钠缓冲液：0.2M NaAc (1.361 克/50ml) 3.7ml0.2M HAc (0.601ml /50ml) 6.3ml加蒸储水至2,000m

2、l。0.2M pH9.5碳酸盐缓冲液：Na? CO 0.32 克NaHCO 0.586 克加蒸储水至50ml再用蒸储水作20倍稀释，即成0.01M pH9.5的碳酸盐缓冲液。NaBH 溶液(4mg/ ml):临用时称取NaBH4mg溶于1ml蒸储水中。0.15M pH7.4 PBSKH2PO4 0.2g TOC o 1-5 h z Na2HPO 4 12H2O2.9gNaCl8.0gKCl0.2g加蒸储水至1000mL饱和硫酸俊操作步骤称取5mgHR解解于1ml蒸储水中。于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO溶液，室温下避光搅拌20分钟， 加入0.16M乙二醇水溶液0.5ml ,混匀，

3、 静置30分钟。将上述溶液装入透析袋中，对1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4c过夜。 加20/0.2M pH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化程 HRP勺pH升高到9.09.5 ,然后立即加入2mg IgG(抗体，或SPA5m斑1ml 0.01M碳酸盐缓冲 液中，室温避光轻轻搅拌2小时。加0.1ml新配的4mg/ml NaBH液，混匀，再置 4c 2小时。将上述液装入透析袋中，对 0.15M pH7.4 PBS透析，4c过夜。结果判定定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定 (光程1cm)。酶量(mg/ ml) = OD403nm 0.4IgG 量(mg/ml) = (OD280nm-OD403nm0.3) X0.62酶量(mg/ml)IgG 量(mg/ml)酶量克分子比值= + = X 440,000160,000IgG 量注意事项(1)为提高标记效率，应严格掌握整个反应体系中的抗体含量。(2)碘酸钠要新鲜配制。在氧化HRPW,以pH5.6醋酸盐缓冲液溶解酶为宜。一般认为氧化HRP 5mgNaIQ量以0.06mol/L0.5ml为宜，不能低于0.015mol/L0.5ml。氧化HRP寸间以15-30min为宜。加入DNFB勺目的是为了封闭酶蛋白中残留的 a-

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