反式白藜芦醇对Aβ235诱导的阿尔茨海默病大鼠海马神经元的保护作用

1、反式白藜芦醇对A B 25-35诱导的阿尔茨海默病大鼠海马神经元的保护作用程青格1 ,徐平1 * ,龚其海2, 陈群3 , 史艳红1（1遵义医学院附属医院神经内科贵州 遵义563000 ;2遵义医学院药理学教研室贵州遵义563000;3遵义市第一人民医院神经内科贵州遵义563000）摘要 目的 观察反式白藜产醇（TR）tAB 25-35诱导AD大鼠海马神经元的保护作用， 并探讨其可能作用机制。方法大鼠随机分为假手术组、阳性对照组（多奈哌齐）、 模型组（AB 25-35）、TR低剂量组、TR高剂量组，每组9只。A B 25-35海马内注射 后，每日一次灌胃，连续15天，阳性对照组给予多奈哌齐1m

2、g- kg 1, TR低剂 量组和高剂量组分别给予 TR10mg kg 1和40mg kg 1,假手术组和模型组给予 同体积的生理盐水。Morris水迷宫检测大鼠学习和记忆能力，HE染色观察海马 神经元损伤情况，实时定量PCRt检测海马APP mRNAft达，免疫组化及 Western Blot检测caspase8s白表达。结果 和模型组比较，TR治疗组在定向航行实验中 逃避潜伏期明显缩短（P0.05），在空间搜索实验中校正潜伏期明显延长（P0.05）, TR明显减轻了海马神经元损伤，TR显著降低了大鼠海马APP mRNA和caspase8 蛋白表达（P0.05）。结论TR对A 0 25-35

3、致AD大鼠海马神经元有保护作用，具 机制可能部分是因为抑制APP mRNAF口 caspase8s白表达有关。关键词： 反式白藜产醇；海马；学习；记忆； APP caspase8Protective effects of trans-resveratrol on hippocampal neurons of ratswith A 25-35 -induced Alzheimer s disease一 一一 11*231CHENG Qing - ge XU Ping , GONG Qi - haiCHEN Qun, SHIYan - hong(1. Department of Neurology

4、 of Affiliated Hospital, Zunyi Medical College Zunyi Guizhou , 563000PR. China; 2. Department of Pharmacology, Zunyi Medical College Zunyi Guizhou , 563000PR. China; 3. Department of Neurology of First peoples Hospital of Zunyi City , Zunyi Guizhou , 563000PR. China)ABSTRACT AIM To investigate the p

5、rotective effects of trans-resveratrol on基金项目：贵州省科技厅社发攻关项目（黔科合SY字20103074）作者简介：程青格（1982）女 河南濮阳 硕士 住院医师 主要从事神经病学研究，E-mail chengqingge163,com通讯作者(correspondent auther ,E-mail: HYPERLINK mailto:xuping527 xuping527hippocampal neurons of rats with A 25-35 -indUced Alzheimer s diseaSeexploreits possible m

6、echanisms. METHODS Rats are randomly divided into sham , positive control (donepezil) , model (A 25-35), low - and high -dose of TR groups, respectively(n=9). After injection of A 25-35 into hippocampus, rats were administrated with 1.0 mg kg 1 donepezil and10 and40 mg kg 1 TR once daily by gavage f

7、or consecutive 15 days respectively, while sham and model groups were administrated with volume-matched normal saline by gavage. The learning and memory ability of rats were detected by Morris water maze test . neuronal injury in hippocampus was observed by hematoty-eosin staining, and the mRNA leve

8、ls of APP were detected by real time PCR and the protein expressions of caspase8 were examined by immunohistochemistry and Western blot in the rat hippocampus. RESULTS Compared with the model rats, Trans-resveratrol treated groups significantly shortened the mean escape latency in the navigation tes

9、t and prolonged the adjusted escape latency in spatial probe test (P0.05). and attenuated neuronal injury in hippocampus, and significantly decreasedthe mRNA expressions of APP and the proteins of caspase8in rat hippocampus (P0.05). CONCLUSION The protective effects of trans-resveratrol on on hippoc

10、ampal neurons of rats with A -35 -induced25 Alzheimer cfesease,The mechanism may be at least partly due to decreasing the mRNA expressions of APP and proteins expression of caspase8 in rat hippocampus.KER WORDS trans-resveratrol; hippocampus ; learning; memory; APcPas; pase8阿尔茨海默氏病(Alzheimer s disea

11、se , AD)又称老年性痴呆，是老年人常见神经系统变性疾病。由于ALK病机制未明，也缺乏特异的治疗手段。国内外 研究处在探索积累阶段。各种原因诱发AD勺共同通品&是脑内AB沉积1, AB为B淀粉样蛋白前体蛋白(APP)水解产物。同时有研究表明ADS者脑内有大量神经 元凋亡，caspase家族凋亡因子表达异常增高2。白藜产醇分为顺式白藜产醇和 反式白藜产醇(trans-resveratrol TR ), TR舌性比顺式白藜产醇作用强。白藜产醇具有抗氧化、消除氧自由基、神经保护等作用3,4。本研究证实了 TRtADfc鼠海马神经元的保护作用，可能与抑制 APP mRNAcaspase8蛋白表达有

12、关。1实验部分1.1实验动物、主要试剂及仪器 清洁级SD雄性大鼠，体重300-350g,由第三 军医大学大坪医院医学实验动物中心野战外科研究所提供，许可证号 sexk（渝）2007-0005。A0 25-35 （Sigma公司），反式白藜产醇（纯度 98% 陕西慈 缘生物技术有限公司），盐酸多奈哌齐（安理中）卫材药业（中国）有限公司制 造，批准文号：国药准字H20070181。APP引物由大连宝生物公司合成，见表 1 所示。caspase8多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司）。SABC&疫组化试 剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），B -actin小鼠单克隆抗体（碧云大生物 技术研究所），

13、PVDF膜（碧云天生物技术研究所）。脑立体定位仪（深圳市瑞沃 德生命科技有限公司），实时荧光定量PCRK （美国BIO-RA必司），逆转录仪（德 国Eppendorf公司）。电泳凝胶成像分析系统（美国 BIO-RA必司）,Leica Owin 细胞图像分析系统（彳惠国leica ） 0 表1引物序列Table 1The sequence of primersGeneForward primer (5-3)Reverse primer(5-3)APPCCAGCCAGTGACCATCCAGAGGCATCGCTTACAAACTCACCAp-actinGGAGATTACTGCCCTGGCTCCTAGA

14、CTCATCGTACTCCTGCTTGCTG1.2方法1.2.1 A 0 25-35制备 AB 25-35用生理盐水解制成1仙g/仙L溶液，37c孵育7天， 变成聚集态，使A。25-35毒性增加，放在4 c备用。动物分组及给药 雄性SD大鼠45只随机分为五组，假手术组，阳性对 照组，模型组，TR低剂量组，TR高剂量组，每组9只。制模结束后灌药，每日 一次，连续灌胃15d。阳性对照组给予多奈哌齐（安理中）1 mg - kg 1,低剂量 组给予TR10mg - kg 1,高剂量组TR40mg - kg 1,假手术组和模型组给予同体积 的生理盐水。动物模型制备雄卜t SD大鼠分为随机分为五组，假手术

15、组，阳性对照组，模型组，TR低剂量组，TR高剂量组，每组 9只。称重，用10%合氯醛 0.35mL/100g体重腹腔注射麻醉后将大鼠固定于脑立体定位仪上，按照脑立体定位图谱，其操作按既往方法进行5,用微量注射器在大鼠双侧海马区注入 A。25-35 , 每侧5 N L（5仙g）,假手术组注入等体积生理盐水，每测注射完毕后留针5分钟， 缝合，术后给予青霉素预防感染。水迷宫行为学分析大鼠造模后第11天开始行水迷宫实验，具体使用方法见参考文献6。每只大鼠连续训练，前四天行定向航行实验，第五天行空间搜 索实验，每天训练2次，结果以逃避潜伏期和校正潜伏期表示。以大鼠寻找安全 岛的时间即逃避潜伏期表示，潜伏

16、期越长，大鼠学习功能越差。第五天行空间探 索实验，记录大鼠120秒所在安全岛的搜索时间，用大鼠在原安全岛搜索时间/120 秒x100%即校正潜伏期，校正潜伏期越长，表示大鼠的学习能力越强。海马神经元形态学观察水迷宫行为检测结束后，每组随机抽取3只大鼠,10%K合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉后打开胸腔，暴露心脏，用大头针刺入左心室 进如主动脉，剪开右心耳，灌注100mLPBS然后灌入100mL4琢聚甲醛固定，断 头取脑，放入4核聚甲醛。取出后固定的各脑区，放入包埋盒中，二甲苯透明， 浸蜡，包埋。切片制备：常规石蜡包埋，冠状切片，HE染色，海马细胞的形态学变化在光学显微镜下观察。APP mRNA达测定

17、水迷宫行为检测结束后，大鼠经10%K合氯醛腹腔注 射麻醉，断头取脑，在冰盘上分离左侧海马组织，将海马放于盛有Trizol的EP管中，按文献6及试剂盒说明书进行提取RNA进行逆转录及扩增。结果分析采 用相对定量法6 oCaspase8免疫组织化学法取材同HE染色，切片后梯度脱水，Caspase8一抗1:50稀释，4c冰箱孵育过夜（采用PBS代替一抗作阴性对照）。再加入生物素标记的二抗，采用 SABC法，按说明书进行操作，DAB溶液显色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片后于显微镜下观察并摄片。400光镜下摄片，通过图像分析软件 Image Plus 6.0进行平均光密度分析。Western

18、blot 检测Caspase8t白表达 水迷宫行为检测结束后，大鼠经 10%K合氯醛腹腔注射麻醉，断头取脑，剥出右侧海马组织，放于盛有500仙L蛋白提取混合液的EPt内，匀浆，冰上静置30min,离心，取出上清液，用BCAI测 定待测样品蛋白浓度。蛋白变性后每空加 80仙g蛋白，用SDS-PAG电泳后，转移 蛋白至PVD膜上，按常规技术操作，兔抗鼠 Caspase8-抗（1:100） , B-actin小 鼠单克隆抗体（1:1000） , 4c过夜孵育。分别与HR标记的羊抗兔和羊抗小鼠IgG 二抗反应（1:1000）, ECLi曾强化学发光法显色，将免疫印迹结果扫描，采用 Quantity O

19、ne定量分析软件系统对蛋白表达进行灰度测定。统计学处理 结果以均数土标准差（x s）表示，应用SPSS17.跳计软件进行one-way ANOVA两两比较时，方差齐性采用LSDt,方差不齐使用DunnettT3法。以P0.05有统计学意义。1.3 结果TR对AD真型大鼠学习记忆能力的影响造模结束后第11天开始行Morris水迷宫检测，结果显示，与假手术组比较，模型组在定位航行实验中逃避潜伏期 明显延长（P0.01）,在空间探索实验中校正潜伏期明显缩短（P0.01）。与模型组 比较，除外第一天TR氐剂量组未见明显差异，余TR&及阳性对照组在定向航行实 验中逃避潜伏期明显缩短（P0.05, P0.

20、01）,在空间探索实验中校正潜伏期明显 增加（P0.05, P0.01）。见表2,图 1。表2水迷宫测试TR对A3 25-35致痴呆大鼠逃避潜伏期和校正潜伏期的影响（达n=9）定向航行实验空间搜索实麟Table4 Effects of TR on the escape latencies and adjusted escape latencies of rats withA 325-35 -induced in the Morris water maze test (s)Gruops(s)(%)First daySecond dayThird dayFourth dayFifth daySha

21、m59.018.225.0 14.520.312.010.34.832.88.4Positive control*65.2 27.8*32.4 21.2*25.1 12.9*12.0 5.8*25.3 5.5Modle98.8 19#972.8 25#067.2 17#862.6 2渣15.6 土 普TR Low-D-G77.7 20.4_. _ * _52.4 14.8*44.8 23.2*30.3 11.5*21.7 4.8TR High-D-G*66.625.9*33.315.1*26.219.7*14.24.7*28.04.9Compared with sham group: # P0

22、.01, Compared with model group:P0.05, P0.01假手状组 阳性组模型组TR低剂量的TR高剂贵机图1大鼠在morris水迷宫实验中的代表性轨迹图Fig.1 The typical track path in rat Morris water maza.TRtAB 25-35诱导A*鼠海马神经元形态学的影响光镜观察发现假手术组（见图2-A）海马神经元排列紧密，结构清楚，细胞核圆大，着色均匀。模型组（见图2-C）海马神经元层次减少，排列紊乱，大量空泡细胞，细胞月中胀，细 胞核体积变小，细胞核碎裂，核固缩，核质浓染，形态不规则，大量神经元发生 嗜酸性变。TR氐剂量

23、组（见图2-D）空泡细胞减少，细胞月中胀减轻，核碎裂、核固缩 减轻。阳性对照组组（见图2-B）及T*剂量组（见图2-E）,海马神经元排列较 整齐，结构清晰，嗜酸性变神经元明显减少。图2 TR对A 3 25-35所致大鼠海马神经元形态学的影响（HEx400）Fig 2 Effects of TR on hippocampal neurons morphologyith A 25-35 -induced rats （HEx400）A:假手术组B:阳性对照组 C:模型组D: TR低剂量组E: TR高剂量组TRtA B 25-35诱导AD大鼠海马APP mRNAft达的影响模型组海马APPmRNAB表

24、达较假手术组明显增高（P0.01）。阳性对照组海马APP mRNA勺表达明 显低于模型组（P0.01） , TR剂量依赖性地降低了大鼠海马APP mRNA的表达（P0.05 , P0.01）。结果见表 3。表3 TRA3 25-35诱导的模型大鼠海马 APP mRNA1达的影响（xs）Table3 Effects of TR on the expressionsof APP mRNA in hippocampus in A3 25-35-inducedrats(n=4, x s)GuopsnAPP mRNA expressionSham457.6 9.9Positive control4*97

25、.7 17.0Modle4171.3 28#lTR Low-D-G4*133.5 23.8TR High-D-G5*100.9 20.3Compared with sham group:#P0.01,Compared with model group:P0.05, P( n=3)GroupsDose/mg kg-1Caspase8平均光密度值Sham0.17 位03Positive control1*0.25 位02Modle#0.41 也02TR Low-D-G10*0.36 也01TR High-D-G40*0.28 也01Compared with shap group: #P0.01;

26、 Compared with model group: P0,05,P0.01western blot法caspase8蛋白表达为直观分析TR对大鼠海马神经元的保护作用，本研究进一步用 western blot法检测了 caspase8蛋白表达的影响，结 果表明，模型组海马caspase8蛋白表达明显高于假手术（P0.01）,阳性对照组 海马caspase8蛋白的表达较模型组明显减少（P0.01） , TR剂量依赖性降低了海 马caspase8蛋白的表达（P0.05, P0.01）。结果见图4。与免疫组织化学检测 结果一致，进一步证实TR抑制了大鼠海马caspase8蛋白表达。图4 A3 25

27、-35诱导的模型大鼠海马caspase8蛋白表达的影响(xis, n=4)。Table 4 Effects of TR on the expressionsof caspase8 protein in hippocampus in rats(x s,n=4)A:假手术组B:阳性对照组 C:模型组D:TR低剂量组E:TR高剂量组Compared with shap group: #* P0.01; Compared with model group: P0,05 ,P0.012讨论研究表明B-淀粉样蛋白在海马内注射可以模拟 A齐习记忆障碍、海马神经 元损伤等行为学和病理学方面特性7 o Morr

28、is水迷宫常用来检测大鼠的学习记 忆能力。本研究模型组大鼠注射AB 25-35后，Morris水迷宫检测模型组中定向航行 实验中逃避潜伏期显著延长，该结果与前期研究结果一致5 ,空间搜索实验中模型组校正潜伏期显著缩短，海马CA仅海马神经元结构损伤明显，这与报道一致， 大鼠脑内注射AB 25-35可以引起神经元损伤，损害其空间记忆能力8 ,同时也证明 此模型成功。在病理情况下，APF过AB生成途径形成AB积聚9。研究表明，APFB了发 挥正常生理作用外，在ADg病过程中起关键作用，APP窜解后产生AB,通过多种 毒性机制，最终引起细胞凋亡、坏死100同时研究表明AB引起神经细胞凋亡主 要通过ca

29、spases依赖性途径11, Caspase8是凋亡启动者，是死亡受体途径关键因 子12。Caspase8通过切割活化，激活下游半胱氨酸蛋白酶，引起凋亡13。目前治疗AD缶床上使用较多的是胆碱酯酶抑制剂。本研究选用多奈哌齐作为阳性对照， 据报道多奈哌齐具有调节APP勺代谢，降解和转运作用14o同时可以有效抑制自 由基产生，减少细胞凋亡发生15。本研究结果表明，模型组海马 APP mRNAcaspase8蛋白表达明显增高，这说明AP坏Dcaspaseg参与了 AD勺发病。而TFffl和阳性对照组，学习记忆能力显著提高，大鼠海马神经元损害明显减轻，同时大鼠 海马APP mRNA达和caspase8

30、蛋白表达较模型组明显减少,并且TR卬制大鼠海马 APPmRNA达和caspase8蛋白表达作用存在剂量依赖性，这说明TRtADg马神经元的保护作用，与下调APPmRNA达和caspase8蛋白表达有关。这不仅拓展了对 阳性药多奈哌齐抗痴呆作用机制的认识，而且发现TRM有与阳性药类似的作用，说明TR台疗痴呆有良好临床应用前景。这与报道一致，TRt神经保护作用，可以 防治AD勺发生16。综上所述，TR寸痴呆大鼠海马神经元有保护作用，作用机制与至少与其抑制 大鼠海马APPmRNA达，caspase8蛋白表达有关，为TR&治AD勺临床研究及治疗 奠定了基础。参考文献1Xu F , Crande AM

31、, Robinson JK , et al. Early onset subicular microvascular amyloid and neuroinflammation correlate with behavioral deficits in vasculotropic mutant amyloid betaprotein precursor transgenic miceJ . Neuroscience, 2007, 146(1): 98-107.2Pompl PN, Yemul S, Xiang Z, et al . Caspase gene expression in the

32、brain as a function of clinical progression of Alzheimer s disease J . Arch Neurol ,2003 ,-376(3) : 3693Chen WP, Su MJ, Huang LM . In vitro electrophysiological mechanisms for antiarrhythmic efficacy of resveratrol , a red wine antioxidantJ . Eur J Pharmacol, 2007, 554(2)： 196-204. 4Goh SS, Woodman

33、OL, Pepe S, et a1. The red wine antioxidant resveratrol prevents cardiomyocyte injury following ischemia-reperfusion via multiple sites and mechanismsJ. Antioxid oRedox Signa1,2007 , 9(1): 101-113.5王顺旺，徐平，刘海军，等 .反式白藜芦醇对 A 825-35致痴呆大鼠海马诱导型一氧化氮表 达的影响J,重庆医学,2010.39(18):2400-2405.6龚其海，丁利静，王丽娜，等 .蛇麻子素减轻脂

34、多糖诱导的大鼠学习记忆减退J.中国新药与临床杂志，2011,30(8):609-614.7李静，周华东，王延江，等.海马注射潴粉样蛋白建立阿尔茨海默病大鼠模型的实验研究J .中国临床神经学，2008, 16(5): 467-471.Diaz A , Mendieta L , Zenteno E, et a1. The role of NOS in the impairment of spatial memory and damaged neurons in rats injected with A 325-35 into the temporal cortexJ . PharmacolBiochem Behav ,