骨髓基质细胞移植对心肌梗塞心肌羟脯氨酸表达

1、骨髓基质细胞移植对心肌堵塞心肌羟脯氨酸表达【摘要】目的：评价骨髓基质细胞移植对组织羟脯氨酸(hyp)含量的影响，讨论细胞移植对心肌堵塞后心室重塑机制。方法：30只日本大耳白兔，随机分为骨髓基质细胞(s)组、安体舒通组、对照组。体外穿刺提取骨髓,别离、培养骨髓基质细胞，s组、对照组心肌堵塞模型制作成功2周后沿堵塞周边区域注射骨髓基质细胞悬液(3109/100l)或de培养基100l，安体舒通组模型制作成功后服用安体舒通20g。心脏超声评价心功能，测定血浆、心肌组织hyp含量、基质金属蛋白酶(p-9)含量，以氯化四唑(tt)染色评价堵塞面积。结果：与对照组、安体舒通组相比，s组心功能进步lvef:

2、(53.222.13)%(56.912.04)%(62.612.37)，p0.05;堵塞面积下降:(29.732.11)%(28.611.24)%(22.823.12)%，p0.05;血浆hyp含量(g/l)显著下降(40.162.31)(34.241.98)(22.791.69)，p0.05;心肌组织hyp含量(g/g湿重)显著下降(3.590.19)(2.670.81)(1.590.89)，p0.05;血基质金属蛋白酶含量(p-9，g/l)显著增加(218.64115.23)(248.16103.9)(719.25312.2)，p0.05。结论：细胞移植可抑制组织羟脯氨酸合成，促进基质金属

3、蛋白酶表达，增加心肌胶原降解，说明干细胞移植可抑制心肌胶原合成、抑制心肌部分间质纤维化，是细胞移植心功能改善机制之一。【关键词】骨髓移植;心室重构;羟脯氨酸abstrat：bjetive:tassesstheeffetfarrstraelltransplantatinnnstitutinhydrxyprlinefyardialinfartininrabbit.ethds:islatedssfr30rabbitsbybnearrpuntureereulturedinellulture.elliplantednteeksaftertheleftanterirdesendingbranhasliga

4、ted.rabbitsasdividedintntrlgrup,antisternegrupandelliplantedgrup.the100lderellsuspensinasinjetedintthebrderareafyardialinfartin.theheartfuntinasassessedbyehardigraphybefreandafterelliplanted4eeks.theareafinfartinereestiatedbytt.thenstitutinhydrxyprlineandp-9ereestiated.results:paredithntrlgrupandant

5、isternegrup,ardiafuntinaeliratedlvef:(53.222.13)%vs.(56.912.04)%vs.(62.612.37)%，p0.05;theareafinfartin(29.732.11)%vs.(28.611.24)%vs.(22.823.12)%，p0.05;plasahydrxyprlineredued(40.162.31)vs.(34.241.98)vs.(22.791.69)，p0.05,andnstitutinhydrxyprlinealsredued(3.590.19)vs.(2.670.81)vs.(1.590.89)，p0.05;thep

6、-9inreased(218.64115.23)vs.(248.16103.9)vs.(719.25312.2)，p0.05insgrup.nlusin:theresultshthatesenhyalsteellstransplantatinanbviuslyaelirateardiafuntin,dereaseinfartinareaandyardiufibrsis.keyrds：bnearrtransplantatin;ventriularredeling;hydrxyprline心肌堵塞(i)后心肌间质纤维化是心室重塑重要因素，更是堵塞后心衰、恶性心律失常等心血管事件发生的病理生理基矗传

7、统药物、介入手术对心室重塑疗效有限。研究发现骨髓基质细胞(arrstraalell，s)移植可改善心功能、心室重塑，其机制尚不明确。心肌羟脯氨酸(hydrxyprline,hyp)是心肌胶原合成标志物之一。本研究观察s移植对i后hyp表达的影响，讨论细胞移植对i后心肌间质纤维化的影响。1资料与方法1.1一般资料35月龄日本大耳白兔30只(武汉大学医学院实验动物中心提供)，体重22.5kg，雌雄不限，随机分为对照组、安体舒通药物治疗组及细胞移植组。胎牛血清(hylne公司)，de培养基(hylne公司)，perll别离液(siga公司)，氯化四唑(2，3，5-triphenyltetrazliu

8、hlrid，tt，上海捷倍思基因技术)。相差显微镜(lypusx170，日本)，彩色多普勒诊断仪(diasnisgateayfax，美国)，北航医学图像分析管理系统(hpias-1000)，羟脯氨酸试剂盒(南京建成工程研究所，中国)。1.2方法1.2.1兔骨髓基质细胞(s)别离培养：见参考文献1。1.2.2细胞移植：以10%乌拉坦经耳缘作静脉麻醉，结扎前降支，制作i模型。2周后，s组、对照组分别沿堵塞周边区域随机选取6个位点依次等量注射细胞悬液或de培养基100l(其中5107细胞/位点)，每一实验动物部分移植的细胞总数量3109。安体舒通组给予安体舒通20g，2次/d，服用1月。1.2.3心

9、功能、心室重塑评估:细胞移植前、后4周，彩色多普勒超声检查。测定左室收缩末期内径(lvesd)、左室舒张末期内径(lvedd)、左室后壁厚度(lvph)，左室短轴缩短率(fs)，每搏输出量(sv)，左室射血分数(lvef)等。1.2.4堵塞面积评估：细胞移植后4周处死动物，自左室心尖至心底每2连续切片5张，置入2%tt溶液，37温箱染色30in。图象分析仪计算堵塞区域在各层心肌中所占比例，重复3次，取平均值，即为堵塞面积。1.2.5血浆、组织羟脯氨酸含量测定：以样本碱水解法测定血浆、组织hyp含量。分别于耳缘静脉取血0.5l及堵塞区域取3小块左室堵塞心肌组织检测血浆、组织hyp含量，测定湿重3

10、0100g，置入玻璃试管，加1l水解液，混匀，95水解20in，流水冷却加指示剂1滴，依次参加调ph甲乙液，使ph值维持在66.8，取34l稀释水解液加适量活性炭，混匀，3500r/in，离心10in，取上清液1l，依次参加hyp试剂1，2，3各0.5l，并混匀静置5in，60水浴15in，冷却后，3500转/in，离心10in，取上清液在550n处，1光径，蒸馏调零，测定空白管及标准管、测定管吸光度。组织hyp含量(g/g湿重)=(测定管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)标准管含量(5g/l)水解液总体积(10l)/组织湿重(g);血浆hyp含量(g/l)=(测定管吸光度

11、-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)标准管含量(5g/l)水解液总体积(l)/取样量(l)。1.2.6基质金属蛋白酶(p-9)检测：采用夹心酶联免疫吸附法(elisa)，试剂盒(huenp-9kit1quantikine)为美国rdsyste公司提供，质量浓度单位为g/l，灵敏度为0.156g/l。1.3统计学处理由spss10.0统计软件完成，计量资料以均数标准差(s)表示，采用单因素方差分析、q检验，p0.05为差异有显著性。2结果2.1细胞培养刚接种的细胞呈球形悬浮于培养液。第34d可见少量单个核细胞贴壁，呈梭形或索条形，分布不均，612d贴壁细胞逐渐增多，部分呈巢状生长，形

12、成多个成纤维样细胞集落，1620d细胞逐渐聚集成片可以传代。2.2心脏超声结果评价与对照组相比，s组、安体舒通组lvef、fs、sv显著进步，lvesd、lvedd显著缩短(p均0.05)，但各组间室壁厚度无显著差异，见表1。表1细胞移植对心功能影响(s)注：各组治疗后与对照组相比p0.05，s移值与安体舒通组相比p0.05。2.3血浆、组织羟脯胺酸及基质金属蛋白酶(p-9)含量测定结果对照组的血清、组织内hyp含量高于其余两组，细胞移植组最低，差异有显著性(p0.050.01)，而细胞移植组的p-9含量显著高于其余两组(p0.05)，见表2。表2血浆、组织羟脯胺酸(hyp)含量比拟注：与对照

13、组比拟p0.05，p0.01;与安体舒通组比拟p0.05。2.4堵塞面积变化tt染色显示对照组心肌堵塞坏死心肌包括心内膜、心肌层、心外膜，表现为部分颜色苍白，细胞移植组那么局限于心外膜或心外膜下(图1)，分布范围小于对照组。图1tt(氯化四唑)染色评价堵塞面积3讨论心肌堵塞后心肌缺血坏死，心肌间质纤维结缔增生，导致心室重塑，进一步引起心力衰竭、心律失常和心源性猝死等严重并发症。阻止或逆转心室重塑的进展，将会延缓并发症的发生，进步患者的生存率。因此通过干预心肌间质纤维化，对于改善心室重塑具有积极意义。病理情况下，心肌部分既存在心肌胶原合成，同时也有心肌胶原降解过程，心肌间质胶原保持合成与降解动态

14、变化。hyp是胶原纤维，尤其是心肌i型胶原主要成分之一，其含量占胶原纤维85%以上，代表着心肌胶原纤维合成，而p那么通过降解胶原纤维，抑制心肌纤维化。检测细胞移植后hyp及p含量变化，可理解心肌间质纤维化情况。与对照组相比，s组、安体舒通组血浆、心肌部分组织hyp低、p-9浓度高，说明两组心肌胶原形成减少，尤其i型胶原纤维形成减少，而胶原降解强，对心室重塑效果好，s组更为明显。其原因可能为：(1)s促进心肌再生和血管新生。研究证实s在心肌部分环境中可分化为心肌样细胞及内皮细胞，前者促进心肌再生，后者那么促进血管新生。tt染色显示细胞移植组坏死心肌集中在心内膜，而心内膜、心肌层极少，而对照组坏死

15、心肌那么广泛分布于心内膜、心肌层、心外膜，细胞移植后心肌坏死区域和范围减小，提示细胞移植促进心内膜、心肌层心肌再生，从源头上预防心肌胶原合成，因此心肌间质hyp含量也降低1，2。p-9含量高，可能与s分化为内皮细胞，促进血管新生，心肌部分缺血改善，心肌胶原分解增加有关;(2)本研究前期研究说明，移植细胞表达心房利钠肽，已证实其可使细胞内环磷鸟苷(gp)浓度升高，刺激核丝氨酸-苏氨酸激酶(akt)基因激活，后者可以抑制缺血心肌hyp表达35;(3)心肌缺血环境可促进体内生物活性因子释放，如转化生长因子-1(tgf-1)，它是目前最有效的促纤维化细胞因子，可促进胶原和结缔组织生长因子等细胞外基质上

16、调和分泌增强，促进成纤维细胞增殖，增加胶原的生成。但在骨髓基质细胞移植中，移植细胞局部分化内皮细胞，一定程度上改善部分缺血环境，抑制了生物活性因子作用，减少心肌部分胶原的生成，故也是s组hyp含量最低原因之一6，7。与安体舒通组相比，s组羟hyp含量更低，可以更好抑制心肌胶原纤维合成，原因可能在于安体舒通仅抑制心肌部分血管紧张素ii、醛固酮介导的成纤维细胞增殖，其抗心肌纤维化作用程度有限，而s移植可从多个环节干预心肌胶原合成，同时促进p表达，增加心肌胶原降解。【参考文献】1蒋雯，林国生，李庚生，等.兔骨髓间充质干细胞自体移植对缺血心肌心功能的影响j.临床心血管病杂志，2022，20(10):605-608.2张蕾，陈沅，田杰，等.骨髓间充质干细胞心肌样分化的微环境因素j.临床心血管病杂志，2022，22(11)：686-688.3方志成，周昌娥，王玮，等.5-氮胞苷对培养兔骨髓基质细胞心房利钠肽表达的影响j.心肺血管病杂志，2022，25(2)：118-121.4katt，uraskij，heny，etal.atr