HSP70C融合草原兔尾鼠卵透明带3对小鼠抗生育的研究

1、HSP70C交融草原兔尾鼠卵透明带3对小鼠抗生育的研究【摘要】目的:讨论分枝杆菌热休克蛋白hsp70对草原兔尾鼠卵透明带3lzp3免疫不育效果的增强作用。方法:将hsp70全长和端分别与lzp3交融构建pd-l-hsp70和pd-l-hsp70重组质粒,同时与具有免疫不育功能的pd-l和pd-al一起分别免疫nih小鼠,分别检测重组质粒在机体真核细胞中的表达情况、t细胞增殖及体液免疫程度、抗生育效果、卵巢的病理变化和免疫荧光定位。结果:lzp3构建的重组质粒均能在小鼠肝脏中表达;免疫后能刺激机体t细胞增殖,尤其是pd-al和pd-l-hsp70免疫组p0.01;同时激发机体产生特异性抗体p0.

2、05;除pd-l-hsp70免疫组外其他3种重组质粒均具有抗生育效果p0.05,且pd-al和pd-l-hsp70极明显地降低了小鼠平均窝仔数p0.01且未引发机体产生卵巢炎;直接免疫荧光结果说明在绿色激发光下小鼠卵母细胞的卵透明带均能发出绿色荧光。结论:与pd-l-hsp70免疫相比,pd-l-hsp70能明显地降低小鼠平均窝仔数,这说明分枝杆菌热休克蛋白hsp70端对增强lzp3免疫不育效果具有明显的基因佐剂成效。【关键词】草原兔尾鼠卵透明带3免疫不育hsp70交融佐剂iunntraeptiveeffetfdnavainesflaguruslagurusznapelluida3fusine

3、dith-terinalfhsp70zhangyu,liyi-jie,azheng-hai,henxuan,panxia-yan,zhangfu-hun*xinjiangkeylabratryfbilgialresuresandgenetiengineering,llegeflifesieneandtehnlgy,xinjianguniversity,uruqi830046;aadeyfanialsienesfxinjianguruqi830000,hinaabstratai:tinvestigatetheiunntraeptiveeffetflaguruslagurusznapelluida

4、3gene(lzp3)fusedbyybateriutuberulsishsp70and-terinalfhsp70.ethds:tiunntrativerebinantplasidspd-l-hsp70andpd-l-hsp70erenstrutedusinglzp3.eanhile,pd-landpd-alhihereeffetiveiunntraeptivevaineserestudiedasntrl.results:afterthelzp3genesereexpressedintheliversfieiththeintrdutinfhydrnaitransfetininsteadftr

5、aditinalhelaelltransfetinbyrt-pr,nihieereiunizedithzp3dnavaines.theresultsfelisashedthatallftherebinantsinieeliitedspeifianti-zp3antibdieshiherebinediththezp3fytesfrtheiunizedieiniunflureseneassay.tsassayshedthatthelyphytesinallgrupsereprliferatedbystiulatingtherebinantlzp3ithndisruptinfflliularinva

6、ries,espeiallythseingrupsfpd-alandpd-l-hsp70(p0.01).antifertilityexperientsshedthatthreegrups(besidespd-l-hsp70)enhanedthesterileeffets(p0.05),espeiallythseinthegrupsfpd-alandpd-l-hsp70(p0.01).nlusin:lzp3fusedbythe-terinalfybateriutuberulsisheatshkprteinhsp70hadagdiunntraeptiveeffethilelzp3fusedbyyb

7、ateriutuberulsisheatshkprteinhsp70hadapreffetnbirthntrl.sthe-terinalfybateriutuberulsisheatshkprteinhsp70ightbeabetterandidatetdelivertheadjuvantfuntininlzp3dnaiunntraeptivevainatinthanthepletehsp70leule.keyrdslaguruslagurusznapelluida3(lzp3);antifertility;hsp70;fusinedadjuvant哺乳动物的卵透明带znapelluida,z

8、p一般由zp1、zp2和zp3或zpa、zpb、zp3种糖蛋白组成,其中zp3含有精子初级受体,是精卵结合过程中精子必须穿过的障碍。大量研究说明,阻断精子与zp3的结合就可以阻断小鼠、猪等的生殖过程,从而实现控制哺乳动物的种群和数量1,2。因此zp3是利用免疫不育技术控制有害哺乳动物的理想靶抗原。热休克蛋白(hsp)是一些进化上非常保守的蛋白质家族分子,其中hsp70家族是hsp中最大的一族,能与相对分子质量(r)差异很大的蛋白质和多肽结合,直接作用于免疫系统上的hsp70受体,很大程度提呈目的基因的表达产物3;另一方面hsp70具有穿插提呈作用4,将其与zp3交融可能会防止dna疫苗引发的自

9、身免疫性卵巢炎。hsp70端具有刺激产生趋化因子、il-12、tnf-、n和促使d细胞成熟及t细胞向th1型极化开展的作用,是hsp70中真正行使佐剂功能的区域5。因此本研究中将草原兔尾鼠卵透明带3laguruslagurusznapelluida3,lzp3基因与hsp70及hsp70端序列分别交融、构建dna疫苗pd-l-hsp70和pd-l-hsp70,同时与具有免疫不育成效的重组dna疫苗pd-l和pd-al2分别免疫小鼠,比拟抗生育效果,探究hsp70端对免疫不育效果的影响,为研制高效的dna不育疫苗奠定理论基矗1材料和方法1.1材料重组质粒pdna3-lzp3pd-l、pdna3-

10、aat-p-lzp3-3d3pd-al、pdna3-lzp3-hsp70pd-l-hsp70和pdna3-lzp3-hsp70pd-l-hsp70由本实验室构建;46周龄雌性nih小鼠购自新疆医科大学动物实验中心;引物及相关测序均由北京奥科生物公司提供完成。1.2方法1.2.1重组质粒的构建、鉴定及纯化设计带有连接子g-s-g-g-s3的交融引物6lzp3-hsp70(n)p1(n)5-aatgaattatgtgtgtgttgtg-3;p2(n):5-aatggatagaagagatagagaagtaagt-3;p3(n):5-aatggatggtggttggattgtgtgggtgggat-

11、3;lzp3-hsp70()p3():5aatggatggtggttggattataggaaggtggg-3;p4():5-aattgagtattggtgg-3。pr分别扩增lzp3、hsp70和hsp70端。用eri/bahi酶切纯化的lzp3,bahi/xhi酶切纯化的hsp70和hsp70,然后将其与eri/xhi酶切的pdna3进展连接,构建成重组质粒pd-l-hsp70和pd-l-hsp70,pr、酶切和测序鉴定重组质粒正确性后用peg8000纯化质粒,hitahiuv3010检测质粒的纯度及含量,然后用生理盐水调整质粒的终浓度至1g/l。1.2.2重组质粒在体内真核细胞中的瞬时表达

12、检测按照水动力体内转染真核细胞学说7,将溶有重组质粒的2.5l生理盐水,快速注入小鼠尾静脉8h后提取小鼠肝脏,rt-pr检测目的基因的表达情况。1.2.3dna疫苗免疫随机将实验小鼠分为7组,每组9只,于小鼠后腿胫骨前肌预免5l/l普鲁卡因100l,24h后在同一部位多点注射质粒dna100l质粒含量1g/l,2周后免疫加强。加强前于小鼠眼眶静脉丛取血,搜集血清,-20备用。1.2.4t细胞增殖实验采用常规的ts检测方法,分别用na、bsa、gst-lzp3刺激脾脏单细胞悬液1106,每组设3个重复。以刺激指数si=各刺激组的a值/未加刺激物组a值测定小鼠淋巴细胞的增殖才能。1.2.5免疫小鼠

13、抗血清的elisa检测采用间接elisa法,以纯化gst-lzp3交融蛋白作为标准抗原蛋白,以-20冻存血清作为一抗,羊抗鼠igg作为二抗,酶标仪检测各孔a450/655值。1.2.6小鼠抗生育实验将免疫80d后的nih雌鼠与具有生育才能的未免疫雄鼠进展11合笼,第2天检测阴栓,检测到的分笼喂养,2023d后计算生仔数。1.2.7小鼠卵巢组织学检测将鼠卵巢组织取出后用40g/l多聚甲醛固定,脱水透明,石蜡包埋,修块切片后做he染色,与生理盐水、pdna3、pdna3-hsp70组作为对照进展分析比拟。1.2.8小鼠卵母细胞的免疫荧光检测将非发情期的实验鼠分别腹腔注射psg10万u/只,hg10

14、万u/只,1415h后处死小鼠,搜集卵丘卵母细胞复合体。透明质酸酶消化后将单个成熟的卵母细胞置于载玻片上,固定,封闭,以-20冻存的血清作为一抗,fit标记的羊抗小鼠igg作为二抗,甘油缓冲液封存后在倒置显微镜下观察、照相。2结果2.1重组质粒的构建及鉴定将真核表达载体pdna3和另外5种重组质粒载体分别进展限制性内切酶酶切和pr检测。电泳结果显示:pd-l、pd-l-hsp70、pd-l-hsp70和pd-al的酶切和pr均得到1100bp左右的lzp3;pd-hsp70和pd-l-hsp70的酶切和pr均得到1900bp左右的hsp70全长;而pd-l-hsp70的酶切和pr那么得到500

15、bp左右的hsp70端;pd-al经3种酶hindiii/xhi/xbai作用后还得到1条2700bp左右的条带,这是3分子的3d。从酶切和pr结果初步推测重组质粒构建正确,测序结果再次证明重组质粒的正确性图1。图1重组质粒的酶切和pr鉴定略fig1restritinenzyedigestinanalysisandprfrebinantplasids1:negativentrlfpr;2,13,16:dl15000arker;3:pdna3pdna3digestedbyhindiii/xhi;4:prfpdna3;5:pdna3-lzp3pdna3digestedbyhindiii/xhi;6

16、:prfpdna3-lzp3;7:pdna3-hsp70digestedbyhindiii/xhi;8:prfpdna3-hsp70;9:pdna3-lzp3-hsp70digestedbyhindiii/bahi/xhi;10:prfpdna3-lzp3-hsp70;11:pdna3-lzp3-hsp70()digestedbyhindiii/bahi/xhi;12:prfpdna3-lzp3-hsp70();14:prfpdna3-aat-p-lzp3-3d3;15:pdna3-aat-p-lzp3-3d3digestedbyhindiii/xhi/xbai.2.2重组质粒在机体真核细胞中

17、表达的rt-pr检测提取小鼠肝脏总rna,然后将其反转录的dna作为模板,用lzp3核心引物和hsp70引物分别扩增目的条带,结果说明几种重组质粒均能在小鼠肝脏中瞬时表达,这说明目的基因可以在真核细胞中进展rna程度上的表达图2。图2水动力技术检测重组质粒在小鼠体内的真核表达略fig2theresultsfplasidsrt-priththehydrdynais-baseddeliveryinuseliverells1:negativentrlfpr;2,13:dl2000arker;3:rt-prfpdna3;4:prfthehlernafpdna3;5:rt-prfpdna3-hsp70;

18、6:prfthehlernafpdna3-hsp70;7:rt-prfpdna3-lzp3;8:prfthehlernafpdna3-lzp3;9:rt-prfpdna3-lzp3-hsp70;10:prfthehlernafpdna3-lzp3-hsp70;11:rt-prfpdna3-lzp3-hsp70;12:prfthehlernafpdna3-lzp3-hsp70;14:rt-prfpdna3-aat-p-lzp3-3d3;15:prfthehlernafpdna3-aat-p-lzp3-3d3;16:dl15000+2000arker.2.3dna疫苗免疫小鼠的t淋巴细胞增殖反响淋

19、巴细胞增殖刺激指数结果说明,与对照相比,pd-l、pd-l-hsp70、pd-l-hsp70和pd-al免疫组均能诱导很强的特异性淋巴细胞增殖反响,其中pd-l-hsp70和pd-al实验组的增殖效果有统计学意义p0.01,说明重组质粒在小鼠体内可以激发特异性的细胞免疫反响。2.4免疫血清中特异性抗体的elisa检测elisa检测结果显示重组质粒免疫组在第1次免疫后血清中都出现了特异性抗体,随着免疫次数的增加,血清中抗体程度均呈上升趋势。与对照组pdna3相比,除pd-l-hsp70组差异有统计学意义p0.05外,其他3组都极明显地进步特异性抗体程度p0.01。2.5抗生育结果spss软件分析

20、抗生育结果说明:和对照组相比,pd-l、pd-l-hsp70、pd-l-hsp70和pd-al4种重组质粒均能使雌性小鼠平均窝仔数下降,pd-l免疫组的平均窝仔数明显减少p0.05,pd-l-hsp70和pd-al免疫组的平均窝仔数极明显地减少p0.01,但2组之间的平均窝仔数没有明显差异;而pd-l-hsp70免疫组的平均窝仔数减少不明显,无统计学意义p0.05。2.6小鼠卵巢组织病理学切片检测小鼠卵巢组织石蜡切片经苏木素-伊红he染色后,与正常小鼠和对照组小鼠卵巢构造相比:免疫组小鼠卵巢构造无明显病理变化,均存在各个发育阶段的卵母细胞,黄体也未出现异常膨大及细胞内和细胞间的炎症反响现象图3

21、。2.7小鼠成熟卵母细胞的免疫荧光检测将超排小鼠的成熟卵母细胞固定到载玻片上进展直接和间接免疫荧光检验,结果发现:无论是间接免疫荧光还是直接免疫荧光,在绿色激发光下,小鼠的卵透明带上均能被激发出绿色荧光图4。3讨论在dna疫苗的开展进程中,选择适宜的佐剂与选择目的基因本身同样重要,本研究中我们将hsp70与抗生育基因lzp3交融讨论其对免疫不育效果的影响。hsp70是一种很好的广谱免疫佐剂,然而一些研究说明hsp70存在一定的局限性,相比之下hsp70端具有更好的免疫佐剂功能。葛菲菲等8发现交融hsp70全长虽使il-2的程度及t细胞增殖有所进步和增强,但效果远不及交融hsp70端免疫组明显,

22、推测可能是由于抗原提呈细胞(ap)外表受体与hsp70结合区域集中在肽连接区,而atp酶区有抑制il-10和tgf-产生的作用,且hsp70会掩盖某些抗原表位,从而降低了hsp70全长载体分子效应,而hsp70肽连接区那么表达了明显的佐剂优势9。随后,li等10同样发现交融hsp70端(359610)的dna疫苗不仅能明显地进步hbsag的特异性tl程度,而且可以克制ld限制性抗原决定簇所造成的抑制作用,同时还可高效去除机体循环系统中的hbsag,大大下调hbv的复制,而交融hsp70n端及全长的dna疫苗却无此功用,认为这也与hsp70359610具有th1样细胞因子和趋化因子功能有关。ar

23、dz等11进一步说明hsp70端能和蛋白酶体作用形成一个指环样的“u型构造,这种由十肽重复序列组成的构造广泛存在于泛素连接酶中,它可使hsp70端交融的目的基因被准确降解,进而被胞吞和高效提呈。基于上述原因,本研究采用15个小分子氨基酸即g-s-g-g-s3作为连接子将不育基因lzp3和hsp70端进展交融表达,为hsp70和lzp3目的蛋白的正确折叠提供更为广阔充分的三维空间构造来增强免疫效果9。结果说明pd-l-hsp70免疫组与pd-l-hsp70相比极明显地激发机体产生特异性的lzp3抗体程度和t细胞增殖才能,说明hsp70端功能相对不明区对增强lzp3的免疫不育具有佐剂增强的生物学功

24、能,且极明显地降低小鼠平均窝仔数,实现了预期防止机体卵巢炎发生的目的,为挑选高效平安的dna不育疫苗控制草原兔尾鼠免疫不育的研究和应用提供了可靠的理论基矗图3免疫小鼠卵巢组织病理切片检测略fig3histlgyf4variansetinsfrdnavainesiunizediea:nn-iunizedie;b:ieintrausularlyiunizedith90l/lsaline;:ieintrausularlyiunizedithpdna3.0;d:ieintrausularlyiunizedithpdna3-hsp70;e:ierallyiunizedithpdna3-lzp3;f:ie

25、rallyiunizedithpdna3-lzp3-hsp70;g:ierallyiunizedithpdna3-lzp3-hsp70;h:ierallyiunizedithpdna3-aat-p-lzp3-3d3.图4小鼠卵母细胞的直接和间接免疫荧光检测略fig4iunfluresenedetetinfdiretinandindiretinfytesa:detetinfytesfrntrlieintransferlight100;b:diretiniunfluresenedetetinfytesfrntrlie100;:detetinfytesfrieiunisedbypdna3-lzp3-

26、hsp70intransferlight200;d:diretiniunfluresenedetetinfytesfrieiunisedbypdna3-lzp3-hsp70200;e:detetinfytesfrntrlieintransferlight100;f:indiretiniunfluresenedetetinfytesfrntrlie100;g:detetinfytesfrpdna3-lzp3-hsp70()ieintransferlight100;h:diretiniunfluresenedetetinfytesfrpdna3-lzp3-hsp70ie100.【参考文献】1lix

27、,shisq,yangy,etal.iungeniityffurpleentarydexyribnuleiaidfragentsfrrabbitznapelluida3andtheireffetsnfertilityj.fertilityandsterility,2022,87(2):381-390.2王焱冰,李轶杰,张富春.分子佐剂3d增强草原兔尾鼠卵透明带3dna疫苗的免疫应答j.分子细胞生物学报,2022,39(4):297-303.3srivastavapk,aatrj.heatshkprteins:thesissaryknifevainesagainstanersandinfetiusagentsj.vaine,2001,19(17-19):2590-2597.4qaziakr,ikanb,vasn