上课：课题3-血红蛋白的提取和分离

1、 蛋白质(protein)是生命的物质根底，是有机大分子，是构成细胞的根本有机物，是生命活动的主要承担者。没有蛋白质就没有生命。 机体中的每一个细胞和所有重要组成局部都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的16%20%，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.612kg。 人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸(Amino acid)按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。蛋白质的重要性第一页，共三十一页。血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要成分，负责运输O2和CO2第二页，共三十一页。课题3 血红蛋白的提取和别离第三页，共三十一页。一、根底知识一蛋白质提取和

2、别离的原理 二蛋白质提取和别离的方法 1、凝胶色谱法分配色谱法 2、电泳法三缓冲溶液二、实验操作蛋白质的提取和别离第四页，共三十一页。 根据蛋白质的物理化学性质差异： 1.分子的形状、大小 2.电荷性质和多少 3.溶解度 4.吸附性质 5.对其他分子亲和力 一思考：蛋白质的种类多种多样，进行蛋白质提取与别离的原理是什么？第五页，共三十一页。1、凝胶色谱法分配色谱法 小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢；大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快。 凝胶是由多糖类化合物如葡聚糖或琼脂糖构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。根据 别离蛋白质的方法。1概念：2材料：3原理：二蛋白质提取和

3、别离的方法相对分子质量的大小第六页，共三十一页。第七页，共三十一页。洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液， 促使蛋白质分子的差速流动。混合物上 柱洗脱大分子流动快小分子流动慢收 集大分子收 集小分子 第八页，共三十一页。2、电泳法2原理： 带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。1电泳：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待别离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的别离。二蛋白质提取和别离的方法

4、第九页，共三十一页。 电泳原理示意图第十页，共三十一页。思考：影响蛋白质分子运动速度的因素决定运动方向电场作用力形成阻力决定运动速率电荷性质电荷量分子形状分子大小第十一页，共三十一页。3常见电泳方法有哪些？琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳4实例 通常使用：十二烷基磺酸钠SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量。应用第十二页，共三十一页。三缓冲溶液 抵抗外界酸碱对溶液pH的干扰而保持 pH稳定。 通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成，如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等。 调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。1、作用： 2、配制：第十三页，共三十

5、一页。二、实验操作实验步骤1.洗 涤 红 细 胞 2.释放血红蛋白 3.分离血红蛋白 透析样品处理纯 化纯度鉴定粗分离 凝胶色谱法 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳谱法第十四页，共三十一页。血液第十五页，共三十一页。血液血浆水分固体物质血浆蛋白无机盐磷脂葡萄糖血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（90）两个a肽链两个一肽链四个亚铁红素基团血液的组成第十六页，共三十一页。二、实验操作实验步骤1.洗 涤 红 细 胞 2.释放血红蛋白 3.分离血红蛋白 样品处理第十七页，共三十一页。1.洗 涤 红 细 胞阅读思考：洗涤的目的是什么？洗涤的方法是什么？洗涤干净的标志是什么？血液100mL3g柠檬酸钠低速

6、离心2 min红细胞血 浆吸出血浆红细胞5倍体积生理盐水搅拌10min重复洗涤3次，直至上清液没有黄色？第十八页，共三十一页。2.释放血红蛋白阅读思考：释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞参加了哪些物质？作用是什么？搅拌的目的是什么？ 分析：蒸馏水的作用是_。参加甲苯的作用是_。充分搅拌的目的是_。使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂第十九页，共三十一页。滤纸过滤脂类物质3.别离血红蛋白 红细胞 混合液高速离心10min 烧杯有机溶剂血红蛋白分液漏斗第二十页，共三十一页。20mmol/L磷酸缓冲液4.透析 透析的目的是什么？1mL1mL1mL 去除样品中的分子较小的杂质。第二

7、十一页，共三十一页。第二十二页，共三十一页。纯化凝胶色谱法1.凝胶色谱柱的制作：2.凝胶色谱柱的装填：3.样品的参加和洗脱教材P68图5-19第二十三页，共三十一页。注意：装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。 思考：你能从凝胶色谱的别离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀，无气泡？扰乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低别离效果。第二十四页，共三十一页。3.样品的参加和洗脱 1.调液面 2.加样 3.再调液面 4.洗脱 5.收集缓冲液凝胶第二十五页，共三十一页。正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。第二十六页，共三十一页。讨论：答：除

8、去相对分子量较大的蛋白质。1、纯化的目的是什么？答：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能。2、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？第二十七页，共三十一页。知识总结血红蛋白的提取和别离蛋白质分子的差异性凝胶色谱法原 理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组 成作 用蛋白质的提取分离样品处理粗 分 离纯 化纯度鉴定第二十八页，共三十一页。例题: 红细胞含有大量的血红蛋白，红细胞的机能主要是血红蛋白完成，血红蛋白的主要功能是携带氧气或二氧化碳。我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和别离血红蛋白，请答复以下有关问题： 1血红蛋白提取和别离的程序可分为四步： 、

9、 、 和 。2实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先参加柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。参加柠檬酸钠的目的是 。 以上所述的过程即是样品处理，它包括 、 、收集血红蛋白溶液。第二十九页，共三十一页。3收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的粗别离。 透析的目的是 。 透析的原理是 。 4然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。 样品纯化的目的是 。血红蛋白有什么特点: 这一特点对进行蛋白质的别离有什么意义？ 第三十页，共三十一页。内容总结蛋白质(protein)是生命的物质根底，是有机大分子，是构成细胞的根本有机物，是生命活动的主要承担者。没有蛋白质就没有生命