依折麦布对兔动脉粥样硬化作用的实验研究

1、依折麦布对兔动脉粥样硬化作用的实验研究【关键词】动脉粥样硬化;脂质蓄积;蛋白激酶;依折麦布1材料与方法1.3实验步骤对照组喂普通饲料，模型组喂高胆固醇饲料(高胆固醇饲料由普通饲料加2%胆固醇配制)，依折麦布干预组在高胆固醇饲料根底上参加5gkg-1d-1依折麦布，连续饲喂12，以镜下见到内膜增生和明显的脂斑突起作为模型制备成功的标志。1.4低密度脂蛋白的别离、氧化修饰及鉴定参照文献3的方法制备低密度脂蛋白。取新颖人血浆100200l，参加PDB以防腐抗氧化，置超速离心机作序列超速离心。提纯的LDL在含200l/LEDTA的磷酸缓冲液(PBS)中透析48h，BA法蛋白定量，uS4氧化，鉴定后过滤

2、除菌，调蛋白浓度至1g/L，4保存。1.5病理形态学分析颈总动脉放血处死动物，取出兔主动脉。PBS漂洗3次，用10%福尔马林固定、梯度乙醇脱水、透明、石蜡包埋、切片(厚度3)，HE染色观察动脉粥样硬化病变的形成。1.6主动脉平滑肌细胞培养及处理无菌条件下取兔主动脉，PBS冲洗35遍，剥去动脉外膜，纵行剖开血管，小心刮去内膜，用DE培养液冲洗一次。剪成13左右的组织块，用弯头接种针将组织块移入25l培养瓶壁上，参加含20%小牛血清的DE培养液5l于对侧瓶底，入培养箱孵育46h，然后轻轻翻转培养瓶，使培养液盖过组织块。此后每3d换液一次。2左右可见VS贴壁长出，待原代细胞交融成致密单层时，用0.2

3、5%胰蛋白酶消化传代，取47代VS用于实验或液氮中冻存。实验分为对照组(DE培养基24h)、xLDL处理组(用50g/lxLDL+DE培养基孵育24h)、依折麦布干预组(用50g/lxLDL+3l/L依折麦布+DE培养基孵育24h)。1.7油红染色将主动脉平滑肌细胞培养于放有盖玻片的6孔培养板内，按照主动脉平滑肌细胞培养及处理方法处理24h后吸弃旧的培养基，用PBS液冲洗3次，每次5in;50%异丙醇固定1in，油红染色10in，苏木素衬染5in，盐酸酒精分色;水性封片剂封片，显微镜观察;细胞内脂滴呈红色，细胞核呈蓝色，图像分析系统搜集图像并于显微镜下摄像保存。参照文献4方法进展脂滴染色的半定

4、量分析，即根据细胞脂滴的面积进展细胞分类。细胞脂滴的面积小于细胞核的面积记为“-;细胞脂滴的面积等于或大于细胞核的面积记为“+即为油红染色细胞。每块玻片计数100个细胞。转贴于论文联盟.ll.1.8高效液相色谱分析将经过处理的平滑肌细胞吸弃旧培养基，PBS洗2次，参加1l0.9%Nal溶液，细胞刮子搜集细胞。冰浴中超声破碎细胞;BA法测定蛋白含量。参照文献5方法进展高效液相色谱(highperfraneliquidhratgraphy，HPL)分析。采用18柱以异丙醇:正庚烷:乙晴为流动相进展非梯度洗脱，流速1l/in，柱温保持4，216n检测8in。以峰面积定量游离胆固醇(F)和胆固醇酯(E

5、)，总胆固醇(T)量为游离胆固醇量加上胆固醇酯的量。1.9PepTagRAssay将处理后的平滑肌细胞提取胞浆胞膜蛋白，BA蛋白检测试剂盒定量后参照文献6方法进展PepTagRAssay操作。可见/紫外分光光度计读取570n的吸光度值，以液化的不含PepTagRPeptide的琼脂糖作为空白值。根据试剂盒提供的数据和Beers定律A=B(A样品吸光度;肽的摩尔吸收率Ll-1-1;B比色杯宽度;样品中肽浓度l/L)逐步计算酶活性(1单位酶活性指每毫升溶液中的磷酸盐每分钟转移至底物的纳摩尔数量)。1.11estern免疫印迹检测将提取的细胞胞膜蛋白BA蛋白定量并煮沸变性后，参照文献6方法进展ABA

6、1、PK和内参照GAPDH的蛋白免疫印迹检测。蛋白条带采用UVP凝胶图像分析系统分析，以各组目的蛋白与内参照蛋白吸光度值的比值比拟待测蛋白的表达差异。1.12统计学方法所得数据采用xs表示，组间比拟采用方差分析及t检验，所有数据用SPSS11.0软件分析。2结果2.1依折麦布对新西兰兔动脉粥样硬化的影响主动脉石蜡切片HE染色显示，饲喂12后对照组主动脉内膜光滑，内皮细胞完好，中膜主要由呈波浪状同心排列的弹性纤维膜构成，基质内可见环形的平滑肌细胞;模型组主动脉内膜以及中膜显著增厚，内皮下间隙蓄积了大量的脂类物质和坏死性物质，中膜弹性纤维层构造不清，细胞排列紊乱;与模型组比拟，依折麦布干预组主动脉

7、内膜和中膜明显变薄，内皮下间隙蓄积物质减少，但仍有蓄积，中膜构造也渐趋好转(图1)。提示依折麦布可以抑制或者逆转高胆固醇饮食诱导的动脉粥样硬化。图1依折麦布对新西兰兔动脉粥样硬化的影响(HE，400)2.2依折麦布对新西兰兔主动脉平滑肌细胞泡沫化过程的影响主动脉平滑肌细胞原代培养并传47代后应用50g/lxLDL或50g/lxLDL+3l/L依折麦布处理24h后，油红染色显示细胞浆内出现红染的小球状脂滴(图2)。脂滴半定量分析结果显示，对照组、xLDL处理组和依折麦布干预组油红染色细胞分别为(132)、(689)、(314)个。与xLDL处理组比拟依折麦布干预组油红染色细胞数明显减少(P0.0

8、5)。高效液相色谱分析显示，50g/lxLDL处理24h后主动脉平滑肌细胞内E与T比值高达57.1%，已经演变为平滑肌源性泡沫细胞;而依折麦布干预组细胞内E和T显著下调，E/T下降至39.6%。提示依折麦布可以减少主动脉平滑肌细胞内胆固醇酯和脂滴的蓄积，进而逆转平滑肌源性泡沫细胞的形成(表1)。胞膜PK表达的影响2.4依折麦布对新西兰兔主动脉平滑肌细胞膜PK活性和PK表达的影响对照组、xLDL处理组和依折麦布干预组新西兰兔主动脉平滑肌细胞胞膜PK活性依次为(0.3110.032)、(0.9750.081)、(0.4250.062)U/l，组间比拟差异显著(P0.05)。estern蛋白印迹分析显示，与xLDL处理组比拟，依折麦布干预组平滑肌细胞胞膜PK表达下调(图4，表2)。提示信号转导的关键酶PK也受到了胆