分子生物学技术课件

1、1 分子生物学技术 -2015级研究生课程 2实验课注意事项安全、环保、规范操作穿白大衣水、电、火仪器设备、腐蚀性毒性试剂纪律不得使用干扰教学秩序的通讯工具和电子设备实验室卫生值日3视频：离心技术实验1：口腔粘膜细胞基因组DNA的制备实验2：apoB基因PCR（加样上机）实验内容4实验一 口腔粘膜细胞基因组DNA的制备5目的通常用于构建基因组文库、Southern杂交（包括RFLP）及PCR分离基因等是一般的基因工程实验中DNA操作的最初步骤核酸分离纯化的总原则保证核酸一级结构完整排除其它分子的污染细胞内：蛋白质、脂类、糖、RNA等提取过程中：有机熔剂、金属离子、外源DNA一、基因组DNA的提

2、取与纯化6提取细胞样品DNA的主要步骤裂解细胞去除细胞内的其它分子：蛋白质多糖脂类去除盐类、有机溶剂等杂质析出DNA7核酸提取注意事项减少化学因素对核酸的降解如过量酸碱减少物理因素对核酸的降解机械剪切力：强烈震荡、渗透压急剧改变、反复冻融高温防止核酸的生物降解核酸酶的预防8二、口腔粘膜细胞基因组DNA的制备实验目的及意义从人口腔上皮细胞中提取纯的基因组DNA掌握基因组DNA抽提的方法，理解核酸分离纯化的基本原理9实验材料及试剂材料：人口腔上皮细胞试剂：抽提缓冲液：Tris-Cl pH8.0 ，EDTA，NaCl， RNAase， SDS，蛋白酶K水饱和酚氯仿/异戊醇（V/V=24:1）75%乙

3、醇、95%乙醇TE缓冲液：Tris，EDTA10实验步骤取材:用生理盐水漱口后，口含生理盐水1015ml约23min，加入15ml离心管，4000rpm 10min ，收集细胞沉淀（离心机的使用，平衡） 加入0.5ml抽提缓冲液，重悬沉淀，转移至1.5ml EP管（微量移液器的正确使用）混匀，65 温育30min 加入等体积的饱和酚, 充分颠倒混匀， 12000rpm5min （不要剧烈震荡！）（高速离心机的使用与安全意识）11 上层水相转移至新的EP管加入等体积氯仿/异戊醇，颠倒混匀 12000rpm5min 上层水相转移至新的EP管加入2倍体积无水乙醇，颠倒混匀， 12000rpm10mi

4、n 12轻轻弃去上清，打开EP盖，室温静置510min加入50 l 0.1TE溶液，充分混匀后检测结果或42 助溶10min后4 保存弃上清，沉淀中加入75%乙醇， 12000rpm2min 1314实验结果及分析定性分析：DNA琼脂糖凝胶电泳定量分析：紫外分光光度法测定DNA溶液 的浓度15常见问题提取的DNA不纯变性不充分；关键过程反应时间过短离心时间或速度不够提取的DNA成涂布状操作过程中用力过猛，动作粗暴操作系统有污染与细胞器DNA分离不全变性过程不完全试剂配制问题16 实验二apoB基因PCR实验（加样和上机）17取4 l 口腔粘膜细胞基因组DNA做PCR，剩余的统一收集于保存盒内反

5、应体系：模板4 l引物2 l酶、dNTP混合物12.5 lddH2O6.5 l总体积25 l反应条件：步骤温度时间预变性94 5min变性94 1min退火+延伸60 4min延伸60 5min30循环实验步骤18微量加样枪使用程序及注意事项1920第一步: 看整体操作按钮容量刻度套头操作按钮容量刻度套头21第二步: 看大小 20 l1000 l100 l100200100调节加样枪容量时切勿超过最大容量，否则加样枪将被损坏!220.5-10l20-200l100-1000l调节加样枪容量时切勿超过最大容量，否则加样枪将被损坏!23第三步: 学调节调节钮切记: 看着刻度调大小刻度24第四步: 学使用一挡吸取二挡放切记:25第五步: 学维护调节加样枪容量时切勿超过最大容量，否则加样枪将被损坏切勿自行拆卸加样枪对腐蚀性及毒性试剂等注意防范26微量加样枪使用程序每次实验课前主管