柳茶多糖的分离纯化及气相色谱质谱分析

1、柳茶多糖的别离纯化及气相色谱-质谱分析【摘要】目的首次提取柳茶中的水溶性粗多糖并进展别离、纯化及组成分析。方法柳茶经热水提娶乙醇沉淀、Sevag法去蛋白、H22脱色，逆向流水透析得多糖精制品。将精多糖衍生化后运用气相色谱-质谱法对其化学成分进展分析。结果确定了柳茶中水溶性多糖分别由核糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，其中以核糖、葡糖糖、半乳糖为主。结论该方法简便、灵敏，可以准确测定出柳茶多糖中所含有的各种单糖。【关键词】柳茶多糖;纯化;气相色谱-质谱;单糖Abstrat：bjetiveTislateandpurifytheater-slubleplysaharidefrLiuhaandanaly

2、zetheheialpsitinfliuha.ethdsTheliuhaasextratedinhtater，thentheplysaharideinthefiltrateasfratinallypreipitatedbyalhl，afterthattheprtEinsinthepreipitatedprdutererevedbySevagreagent，hydrgenperxidedelr，thehydrlysatefplysaharideasdialyzedbythereversefltgetthefineprdut.Finally，theheialpsitinsfthefineprdut

3、afterderivatizatinereexainedbythegashratgraphy-assspetretrianalysis.ResultsTheplysaharidesarepsedfribse，annse，gluseandgalatse.Theajrnsaharidepnentsareribse，galatseandgluse.nlusinTheethdreprtedinthispaperissiple，andanbeusedfranalysisfnsaharideshydrlyzedfrLiuhaplysaharide.Keyrds：Liuhaplysaharide;Purif

4、y;Gashratgraphy-assspetretry;nsaharide柳茶为藏族民间常用药，以蔷薇科(Rsaeae)鲜卑花属(Sibiraea)植物窄叶鲜卑花Sibiraeaangustata(Rehd.)Hand-azz.和鲜卑花Sibiraealaeigata(L)axi.的枝叶及果序(带果实的果枝)入药，主要用于消食导滞、疏散风热;据藏药文献记载，柳茶主治热病和疫病1。现藏族民间常作茶饮，治疗食后腹胀等诸多原因引起的消化不良，每每见效。柳茶中除含有挥发油、微量元素外，通过实验发现还含有丰富的多糖。多糖作为进步机体免疫功能的保健品已被许多人承受，但许多多糖产品仅仅停留在保健品阶段，未

5、能开发成药物，主要原因是多糖的别离纯化困难，技术不过关。因此本文旨在对柳茶多糖的提娶纯化、组分分析进展研究并对其营养保健功能进展讨论，以期为柳茶的开发及其综合利用提供参考。1仪器与材料1.1仪器UV-2450紫外分光光度计(日本岛津);NE2155电子天平(德国赛多利斯仪器公司);Agilent5793I-6890气相色谱-质谱联用仪(G-S);SE-54弹性石英毛细管柱(500.25id0.50);高纯氦(纯度99.999%);旋转蒸发仪(上海青浦泸西仪器厂)。1.2材料鲜卑花属植物叶采自甘肃省甘南藏族自治州合作市郊，海拔3200以上。经兰州大学药学院生药学研究所杨永建教授鉴定其为蔷薇科(R

6、saeae)鲜卑花属(Sibiraea)植物窄叶鲜卑花Sibiraeaangustata(Rehd.)Hand-azz.和鲜卑花Sibiraealaeigata(L)axi.的叶。单糖标准品葡糖糖、阿拉伯糖、核糖、甘露糖、木糖、果糖、半乳糖标准品(Fluka公司)，盐酸羟胺、吡啶、三氟乙酸、乙酸酐、氯仿以及其他试剂等均为国产分析纯，蒸馏水为实验室自制。2方法2.1多糖的提取与纯化2.1.1粗多糖的提取取一定量的柳茶依次用石油醚、乙醚除去脂溶性杂质。加10倍量的水90100提取3次，3h/次，合并水提液，过滤。70水浴减压浓缩至适量，参加5倍量95%的乙醇纯析，静置过夜，离心过滤，置真空冷冻枯燥

7、得柳茶多糖粗品。2.1.2粗多糖纯化2将多糖粗品溶于蒸馏水，去不溶物，按Sevag法(氯仿正丁醇=41)脱蛋白，重复10次以上，然后移至透析袋中用去离子水逆流透析24h，直至紫外光谱分析检测无蛋白吸收。以氨水调节pH为8，滴加H22，50保温脱色2h，减压浓缩，参加5倍量的无水乙醇，静置过夜，离心搜集沉淀，将沉淀依次用无水乙醇、丙酮、乙醚漂洗2次，冷冻枯燥得去蛋白多糖纯品。2.1.3紫外光谱分析取柳茶多糖适量，加水溶解，配制成浓度为1.0g/L的多糖水溶液，采用紫外可见分光光度法190700n范围内扫描。光谱显示柳茶多糖具有多糖特征性的紫外吸收图谱仅在200n处有一锐细吸收峰，大于250n无明

8、显的紫外吸收，是平坦的背景。结果说明，提取纯化的多糖中不含有核酸、蛋白质以及其他杂质成分。转贴于论文联盟.ll.2.2柳茶多糖的气相色谱质谱测定2.2.1供试品溶液(糖腈乙酰酯衍生物)的制备称取20g柳茶纯化多糖样品溶于2l21/L的TFA中，封管，于100水解6h，减压除尽TFA。在水解产物中参加20g盐酸羟胺和1l吡啶，封管于90反响30in。冷至室温，再参加1l乙酸酐，封管于90反响30in，冷却后转出上层清液，减压浓缩至干。滴入0.5l氯仿溶解后进展气相色谱质谱分析。2.2.2对照品溶液的制备精细称取单糖标准品葡糖糖、阿拉伯糖、核糖、甘露糖、木糖、果糖、半乳糖对照品20g，采用上述方法

9、制备乙酰化衍生物，氯仿溶解后进展气相色谱质谱分析。2.3G-S分析条件2.3.1色谱条件SE-54毛细管柱，气化室温度270，柱前压17.8kPa，分流比301，采用恒流形式载气He流量1.2l/in，进样量1l，程序升温：起始温度100保持6in，以20/in升至220保持14in，以5/in升至290。2.3.2质谱条件电子轰击源(Ei)，电子能量70eV;离子源温度：230;四极杆温度：150;传输杆温度：280;扫描范围：14400au。3结果3.1单糖标准品和柳茶多糖的GS分析3.1.1混合单糖标准品乙酰化衍生物的总离子流图见图1。根据单糖标准品的乙酰化衍生物的G-S的总离子流图，确

10、定7种混合单糖标准品的G一S总离子流图的出峰顺序为果糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。3.1.2柳茶多糖的乙酰化衍生物的总离子流图见图2。根据柳茶多糖的总离子流图，通过各峰的保存时间和标准质谱尼斯特谱库(NIST)对照分析可以确定其含有核糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，出峰时间及其组成含量见表1。4讨论分析多糖中单糖组成，首要的工作就是将多糖样品进展彻底的水解。因为假如水解效果不理想，多糖很难完全水解为单糖或者仅仅有很少局部水解，导致样品水解衍生化产物在气相色谱分析中峰值很小，从而影响多糖中含量较少的单糖测定。通过对影响水解效果的各种因素的综合考察分析，得出对于柳茶多糖的水解应采用

11、2l21/L的TFA水解6h较为适宜。在此水解条件下，可以使多糖较为完全地水解。而硫酸也可用于多糖的水解，但实验时采用低浓度的硫酸水解时效果不理想，高浓度的硫酸那么易造成多糖的碳化。且由于硫酸沸点比拟高，水解后残留的酸不容易挥发除去，必须用碳酸钡中和处理，容易造成样品组分的损失。表1柳茶多糖中的单糖含量柳茶多糖在空气中提取或枯燥时颜色会加深，可用过氧化氢或活性炭脱色，活性炭在脱色时使用量大，样品损失较多，故采用H22脱色。在用过氧化氢脱色处理后，一定要透析至无过氧化氢检出，H22检出用高锰酸钾法。此外，在醇洗及醚洗、抽滤时用薄膜盖住样品，可减少空气接触，防止颜色加深。在脱色时50保温脱色2h，时间短色素太多影响检测结果，时间长也没有更好的脱色效果。柳茶中除含有挥发油、微量元素、三萜类化合物等多种化学成分外，课题组发现其所含多糖也是其主要活性成分之一;多糖作为药物应用是在20世纪40年代，自20世纪60年代以来，人们陆续发现多糖具有更多的生物活性。不仅具有免疫调节功能，还可以抗感染、降血糖和抗肿瘤等，随着多糖类化合物研究的深化，其在抗肿瘤和病毒的临床治疗方面显示了