蛋白质工程及应用

1、第三章 蛋白质工程及其在食品工业中应用第1页概述 蛋白质是对生命至关主要一类生物大分子物质，各种生命功效、生命现象、生命活动都和蛋白质相关。在生命有机体催化、运动、结构、识别和调整等许多方面，起着关键作用。第2页酶.几乎全都是蛋白质。肌肉收缩、精子移动、细胞分裂过程中染色体移动.高等生物有序生长和分化过程。抗体蛋白能识别和结合特异性外源物质，使人体具备抵抗各种细菌、真菌和病毒能力。由神经细胞膜蛋白组成离子通道，负责神经冲动形成和传导。血红蛋白含有结合和释放氧能力，是血液中氧、二氧化碳和氢离子携带者。另外，人体毛发和指甲属于角蛋白，而血栓是由血纤蛋白单体聚合而成。第3页蛋白质生物学功效1.催化功

2、效：酶2.调整功效：激素3.结构功效：皮、毛、骨、牙、细胞骨架4.运输功效：血红蛋白5.免疫功效：免疫球蛋白6.运动功效：鞭毛、肌肉蛋白7.储备功效：酪蛋白8.生物膜功效：及神经传导等第4页 蛋白质是生命表达者，离开了蛋白质，生命将不复存在。可是，生物体内存在天然蛋白质，有往往不尽人意，需要进行改造。因为蛋白质是由许多氨基酸按一定次序连接而成，每一个蛋白质有自己独特氨基酸次序，所以改变其中关键氨基酸就能改变蛋白质性质。而氨基酸是由三联体密码决定，只要改变组成遗传密码一个或两个碱基就能到达改造蛋白质目标。蛋白质工程一个主要路径就是依据人们需要，对负责编码某种蛋白质基因重新进行设计，使合成蛋白质变

3、得更符合人类需要。第5页蛋白质工程就是以蛋白质结构与功效为基础，利用基因工程伎俩，按照人类本身需要，定向地改造天然蛋白质，甚至创造新、自然界本不存在、含有优良特征蛋白质分子。蛋白质工程概念1983年，美国生物学家额尔默首先提出了“蛋白质工程”概念。蛋白质工程实践依据DNA指导合成蛋白质，所以，人们能够依据需要对负责编码某种蛋白质基因进行重新设计，使合成出来蛋白质结构变得符合人们要求。第6页详细地说，蛋白质工程就是经过对蛋白质已知结构和功效了解，借助计算机辅助设计，利用基因定点诱变等技术，特异性地对蛋白质结构基因进行改造，借以改进蛋白质物理和化学性质（热稳定性、酶专一性）， 或利用化学和物理伎俩

4、，对目标基因按预期设计进行修饰和改造，合成新蛋白质。并由此深入研究蛋白质结构与功效关系。蛋白质工程概念蛋白质工程蛋白质工程就是利用蛋白质结构功效和分子遗传学知识，从改变或合成基因入手，定向地改造天然蛋白质或设计制造新蛋白质第7页三个步骤：1、取得目标蛋白质晶体，并利用X射线技术经过晶体衍射仪搜集衍射数据，然后对晶体进行测量、分析，确定蛋白质空间结构。2、借助计算机对蛋白质进行饰变，经过建立数据库和人工智能等路径确定蛋白质结构和功效关系确定需要修饰位点。蛋白质工程目标和研究过程目标：依据人们需要改造天然蛋白质或设计创造自然界原来没有全新蛋白质第8页三个步骤：3、利用定点突变技术等一系列基因操作技

5、术伎俩来改变编码蛋白质基因，从而实现对蛋白质改变。对已经存在蛋白质“下手”，从结构测定入手。创造全新蛋白质，要依据已经有蛋白质结构和功效信息资料进行分子设计-基因表示-对表示产物结构和功效进行检测、分析。必经之路：（饰变、分析、检测、修改）*N蛋白质工程目标和研究过程第9页 蛋白质工程是在深入了解目标蛋白质“结构-功效 ”关系基础上，进行严格分子设计，定向改造一个预期新特征蛋白质。普通两种情况：对天然蛋白质进行改造。（已经有蛋白质）完全重建一个自然界原来没有蛋白质。（全新）对天然蛋白质操作有：少数几个AA残疾进行替换（小改）分子剪裁（中改）局部重建（大改）第10页 重建一个自然界原来没有蛋白质

6、： 从头设计一个全新蛋白质 当前，蛋白质工程主要进行是中改、小改。 “大改”和“从头设计”，要求必须全方面掌握蛋白质一级结构决定高级结构规律，掌握高级结构与功效相关性。 现存蛋白质数据库还满足不了对蛋白质空间结构研究 第11页实例1：玉米中赖氨酸含量比较低 假如对赖氨酸合成过程中两个关键酶进行改造,能够使玉米叶片和种子中游离赖氨酸分别提升5倍和2倍。 原因：赖氨酸合成过程中两个关键酶天冬氨酸激酶和二氢吡啶二羧酸合成酶活性，受细胞内赖氨酸浓度影响。当赖氨酸浓度到达一定量时，就会抑制这两种酶活性。第12页 人类蛋白质组计划是继人类基因组计划之后，生命科学乃至自然科学领域一项重大科学命题。年，国际人

7、类蛋白质组组织宣告成立。之后，该组织正式提出开启了两项重大国际合作行动：一项是由中国科学家牵头执行“人类肝脏蛋白质组计划”；另一项是以美国科学家牵头执行“人类血浆蛋白质组计划”，由此拉开了人类蛋白质组计划帷幕。第13页“人类肝脏蛋白质组计划”是国际上第一个人类组织器官蛋白质组计划，由我国贺福初院士牵头，这是中国科学家第一次领衔重大国际科研协作计划，总部设在北京，当前有16个国家和地域80多个试验室报名参加。它科学目标是揭示并确认肝脏蛋白质，为重大肝病预防、诊疗、治疗和新药研发突破提供主要科学基础。人类蛋白质组计划深入研究将是对蛋白质工程有力推进和理论支持。 第14页思索：对天然蛋白质进行改造，

8、你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是经过对基因操作来实现？应该从对基因操作来实现对天然蛋白质改造，主要原因以下：（1）任何一个天然蛋白质都是由基因编码，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且改造过蛋白质能够遗传下去。假如对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造过蛋白质分子还是无法遗传。（2）对基因进行改造比对蛋白质直接改造要轻易操作，难度要小得多。 第15页二、蛋白质工程基本原理1、蛋白质工程目标 依据人们对蛋白质功效特定需求，对蛋白质结构进行分子设计。2、天然蛋白质合成过程DNA（基因）转录mRNA翻译蛋白质基因表示（转录和翻译）形成氨基酸序列多肽链形成含有高级结构蛋白质行使生物功效第16页

9、中心法则 （central dogma）生物遗传信息从 DNA传递给mRNA过程称为转录。依据mRNA链上遗传信息合成蛋白质过程，被称为翻译和表示。1958年Crick将生物遗传信息这种传递方式称为中心法则。第17页蛋白质翻译转录逆转录复制复制DNARNA中心法则：遗传信息由DNA mRNA 蛋白质流动路径。补充和完善之处：A：RNA作为遗传物质能自我复制，并作为mRNA指导PRO合成。 B：RNA能以逆转录方式将遗传信息传递给DNA分子。 第18页 复制：是亲代双链DNA按碱基配对标准，准确形成两个相同核苷酸序列子代DNA分子过程。两条DNA链都可作为复制模板。 转录：是以一条DNA链为模板

10、，将DNA链上储存遗传信息按碱基配对标准准确转换成互补mRNA过程。 翻译：是以mRNA为模板，将mRNA上遗传信息转换成蛋白质氨基酸序列过程。 中心法则：遗传信息由DNA mRNA 蛋白质流动路径。 第19页第20页第21页、蛋白质工程基本路径预期蛋白质功效设计预期蛋白质结构推测应有氨基酸序列找到相对应脱氧核苷酸序列（基因）第22页讨论：某多肽链一段氨基酸序列是：丙氨酸色氨酸赖氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸（1）怎样得出决定这一段肽链脱氧核苷酸序列？请把对应碱基序列写出来。首先应该依据三联密码子推出mRNA序列，每种氨基酸都有对应三联密码子，只要查一下遗传密码子表，就能够将上述氨基酸序列编码序列查出来

11、。再依据碱基互补配对规律推出脱氧核苷酸序列。不过因为上述氨基酸序列中有几个氨基酸是由多个三联密码子编码，所以其碱基排列组合起来就比较复杂，最少能够排列出16种。第23页密码子：UCAUGAUUAmRNA密码子密码子密码子mRNA上决定一个氨基酸三个相邻碱基密码子总数：43=64种(其中61种密码子是对应氨基酸 和起始；另有3个不对应氨基酸，只对应终止)1种密码子只对应1种氨基酸；1种氨基酸能够对应各种密码子。 密码子在生物界基本是通用。这也是生物彼此间存在亲缘关系证据之一 。第24页第25页GCU（或C或A或G）UGGAAA（或G）AUGUUU（或C） mRNA序列 脱氧核苷酸序列GCT (或

12、C或A或G) TGGAAA (或G)ATGTTT (或C)CGA (或G或T或C) ACCTTT（或C)TACAAA (或G)（2）确定目标基因碱基序列后，怎样才能合成或改造目标基因（DNA）？确定目标基因碱基序列后，就能够依据人类需要改造它，经过人工合成方法或从基因库中获取。第26页4、蛋白质工程与基因工程关系 蛋白质工程是在基因工程基础上，延伸出来第二代基因工程，是包含多学科综合科技工程领域。 基因工程是经过基因操作把外源基因转入适当生物体内，并在其中进行表示，它产品是该基因编码天然存在蛋白质。第27页 蛋白质工程就是依据蛋白质精细结构与功效之间关系，利用基因工程伎俩，按照人类本身需要，定

13、向地改造天然蛋白质，甚至创造新、自然界本不存在、含有优良特征蛋白质分子。 蛋白质工程自诞生之日起，就与基因工程密不可分。蛋白质工程依据对分子预先设计方案，经过对天然蛋白质基因进行改造，来实现对它所编码蛋白质进行改造。所以，它产品已不再是天然蛋白质，而是经过改造、含有了人类所需要优点蛋白质。第28页5 蛋白质工程与酶工程关系 绝大多数酶都是蛋白质，酶工程与蛋白质工程有什么区分？ 酶工程就是指将酶所含有生物催化作用，借助工程学伎俩，应用于生产、生活、医疗诊疗和环境保护等方面一门科学技术。概括地说，酶工程是由酶制剂生产和应用两方面组成。酶工程应用主要集中于食品工业、轻工业以及医药工业中。 第29页

14、通常所说酶工程是用工程菌生产酶制剂，而没有经过由酶功效来设计酶分子结构，然后由酶分子结构来确定对应基因碱基序列等步骤。所以，酶工程重点在于对已存酶合理充分利用，而蛋白质工程重点则在于对已存在蛋白质分子改造。当然，伴随蛋白质工程发展，其结果也会应用到酶工程中，使酶工程成为蛋白质工程一部分。 第30页 蛋白质分子生物功效，与蛋白质分子结构密不可分。决定蛋白质这种特殊生物功效关键原因是它分子构象 。蛋白质结构 第31页基本组成单位-氨基酸第32页组成生物体蛋白质20种氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸丙氨酸精氨酸天冬酰氨天冬氨酸半胱氨酸谷氨酰胺谷氨酸甘氨酸组氨酸异亮氨酸亮氨酸赖氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸脯氨酸

15、丝氨酸苏氨酸色氨酸酪氨酸缬氨酸第33页组成生物体蛋白质20种氨基酸氨基酸英文氨基酸英文赖组脯苏丝色天冬精LysHisProThrSerTryAspArg LysineHistidineProlineThreonineSerine TryptophanAspartic acid Arginine谷缬半胱丙亮酪甲硫(蛋)Glu Val CysAla LeuTyrMetGlutamic acidValineCysteineAlanineLeucineTyrosineMethionine甘苯丙GlyPheGlycinePhenylalanine谷酰天冬酰异亮Gln AsnIle GlutamineAs

16、paragineIsoleucine第34页 肽（肽键与肽) 肽键就是由氨基酸-羧基与相邻氨基酸-氨基脱水缩合而形成化学键第35页肽（肽键与肽)肽:氨基酸经过肽键连结起来化合物二肽:两个氨基酸形成肽三肽:三个氨基酸形成肽多肽:许多氨基酸形成肽蛋白质:大多为100个以上氨基酸组成多肽第36页氨基酸残基:多肽链中不完全氨基酸。氨基酸因为形成肽键而失去了一分子水，所以表现出其分子不完整。氨基末端：多肽链中含有自由-氨基一端。简称N-端羧基末端：多肽链中含有自由-羧基一端。 简称C-端第37页第38页蛋白质一级结构 蛋白质一级结构是指氨基酸按一定次序经过肽键相连而成多肽链，也是蛋白质最基本结构。每一个

17、蛋白质分子都有自己特有氨基酸组成和排列次序即一级结构，由这种氨基酸排列次序决定它特定空间结构，也就是蛋白质一级结构决定了蛋白质二级、三级等高级结构。第39页蛋白质分子一级结构牛胰岛素一级结构第40页（1）氢键：氢原子与负电性强原子（如氧、氮等）间形成。对蛋白质分子三维构象维护很主要。（2）静电引力：正负带电基团之间吸引力。对蛋白质分子三维构象稳定贡献不是很大，也称为离子键或盐键（3）范德华力：原子团相互靠近时诱导所致。它改变多样，对维持蛋白质活性中心构象影响很大维持蛋白质空间结构化学键第41页（4）疏水相互作用：是非极性基团为了避开水相而群集在一起作用力。疏水作用是维持蛋白质高级结构主要原因（

18、5）二硫键：作用很强，对稳定蛋白质构象起主要作用氢键、离子键、疏水作用和范德华力等次级键是非共价键肽键、二硫键、酯键等被称之为共价键第42页蛋白质二级结构 二级结构是指多肽链借助于氢键沿一维方向排列成含有周期性结构构象，是多肽链局部空间结构（构象）主要形式：-螺旋、-折叠、 -转角、无规卷曲等第43页第44页-转角第45页蛋白质分子二级结构 螺旋折叠片转角自由回转第46页第47页三级结构三级结构是指整条多肽链在二级结构基础上深入盘曲而成特定格式三级结构。四级结构很多蛋白质分子是由两个或两个以上独立、含有三级结构多肽链组成。这些多肽链之间只是经过疏水作用等次级键结合成为有序排列特定空间结构，形成

19、了四级结构。在四级结构蛋白质分子中，每个含有三级结构多肽链单位称为亚基，亚基多无生物学活性，含有完整四级结构蛋白质分子才有生物活性。第48页血红蛋白中四亚基两两相同，分别称为1 、2、1、2第49页第50页第51页 蛋白质结构和功效关系 1、蛋白质一级结构与功效关系（1）相同结构含有相同功效。 一级结构相同多肽或蛋白质，其空间结构及功效也相同。 催产素、抗利尿激素都是由下丘脑神经细胞合成九肽类激素,前者含有催产及使乳腺(Phe作用.如图为催产素结构简式,若将异亮氨酸(He)和亮氨酸(Leu)分别替换为苯丙氨酸和精氨酸则为抗利尿剂。催产素兼有抗利尿剂激素作用，抗利尿剂激素也兼有催产素作用。第52

20、页 蛋白质结构和功效关系 1、蛋白质一级结构与功效关系（2）不一样结构含有不一样功效 尽管催产素、抗利尿激素有相同功效，但它们结构并不完全相同，所以生物学活性也有很大差异 催产素催产功效强于抗利尿剂激素。 抗利尿剂激素利尿作用远强于催产素。 所以，一级结构发生改变，其功效必定改变。第53页 蛋白质结构和功效关系 2、蛋白质空间结构与功效关系 蛋白质空间结构是其生物活性基础，空间结构发生改变，其功效也必定随之改变。 核糖核酸酶，不破坏它一级结构，只是破坏其氢键，二硫键还原为巯基，该酶也会失去活性。 原因：二级、三级结构发生改变 恢复结构，酶活性也可得到恢复。第54页 食品蛋白改性 人类迫切需求具

21、有功能特征和营养特征蛋白质 一方面，开发蛋白质资源（优质蛋白）。 其次，对现有蛋白质进行改造-改性蛋白质。 蛋白质改性是指经过物理、化学和生物 (酶)方法改变蛋白质结构，从而改善它们功能特征，使之达到食品所需要品质特征，以扩大蛋白质在不一样类型食品体系中应用范围。 实质：利用生化因素或物理因素切断蛋白质分子中主链或是对蛋白质分子侧链基团进行修饰，从 而引发蛋白质空间结构和理化性质改变，获得具有功能特征和营养特征较好蛋白质。第55页蛋白质改造方法 在基因水平上对蛋白质进行改造，按改造规模和程度能够分为：小改：个别氨基酸改变和一整段氨基酸序列删除、置换或插入中改：蛋白质分子剪裁，如结构域拼接大改：

22、局部重建从头设计合成新型蛋白质 第56页一、小改造经过基因突变方法，以到达改变氨基酸进而改造蛋白质目标。当前，主要采取基因突变方法：基因定点突变盒式替换技术第57页基因定点突变依据三联体密码，编码DNA（目标基因）确实定位点，改变其组成核苷酸次序或种类，使基因发生定向变异，使其控制合成氨基酸种类、次序发生改变，合成出含有预期氨基酸序列修饰蛋白质。这种经过造成一个或几个碱基定点突变，以到达修饰蛋白质分子结构目标技术，称为基因定点突变技术。第58页1985年Wells提出一个基因修饰技术，可经过一次修饰，在一个位点上产生20种不一样氨基酸突变体，从而能够对蛋白质分子中一些氨基酸进行“饱和性”分析。

23、利用定位突变在拟改造氨基酸密码两侧造成两个原载体和基因上没有内切酶切点，用该内切酶消化基因，再用合成发生不一样改变双链DNA片段替换被消化部分。这么一次处理就能够得到各种突变型基因。 盒式突变技术 第59页二、蛋白质分子高级改造（结构域拼接） 研究证实，在二级结构和三级结构之间还有一个结构层次，即结构域结构域由螺旋、折叠等二级结构单位按一定拓扑学规则组成三维结构实体。结构域是蛋白质分子中一个基本结构单位，结构域拼接是经过基因操作把位于两种不一样蛋白质上几个结构域连接在一起，形成融合蛋白，它兼有原来两种蛋白性质。 第60页三、全新蛋白质设计与构建 上述两种蛋白质改造方法，通常是从一个已知次序、结

24、构和功效蛋白质出发，依据一定目标和设计方案，使用多肽合成或者基因工程方法，改变它结构，以期到达改变其性质目标。假如要从头设计和构建一个自然界不存在蛋白质，则需要借助多功效模板和蛋白质二级结构元件组装成某种含有特定功效人工蛋白质分子。 第61页蛋白质工程在食品工业中应用 蛋白质工程自问世以来，短短十几年时间，已取得了引人瞩目标进展，在医学和工业用酶方面也取得了良好应用前景。 提升蛋白质稳定性包含以下几个方面：延长酶半衰期；提升酶热稳定性；延长药用蛋白保留期；抵抗因为主要氨基酸氧化引发活性丧失。 第62页一、消除酶被抑制特征 1985年，美国埃斯特尔借助寡核苷酸介导定位突变技术，用19种其它氨基酸

25、分别替换枯草芽孢杆菌蛋白酶分子第222位残基上易氧化甲硫氨酸，取得了一系列活性差异很大突变酶。发觉除了用半胱氨酸代替甲硫氨酸突变体以外，其它突变体酶活性都降低了。 第63页二、引入二硫键，改进蛋白质热稳定性 溶菌酶分子：由一条肽链组成，并在空间上折叠形成二个相对独立结构域，酶活性中心位于二个结构域之间。该酶分子在第97位和54位残基上是两个未形成二硫键半胱氨酸因为二硫键是一个稳定蛋白质分子空间结构主要共价化学键，有如建筑所用钢筋一样，因而能将分子中不一样部位牢靠地联结在一起。所以，提升酶热稳定性最惯用方法是在分子中增加一对或数对二硫键。 第64页在高温下天冬酰胺和谷氨酰胺轻易脱氨形整天冬氨酸和谷氨酸，而造成蛋白质分子构象改变，使蛋白质失去活性。对酿酒酵母磷酸丙糖异构酶进行诱变改造。这种酶有两个相同亚基，每个亚基含有2个天冬酰胺，因为它们都位于亚基之间界面上，可能对酶热稳定性起决定性作用。经过寡核苷酸介导定向诱变技术，将第14位和第78位上2个天冬酰胺分别转变成Thr(苏氨酸)和Ile(异亮氨酸)残基，大幅度提升突变酶热稳定性。 三、转化氨基酸残基，改进蛋白质热稳定性 第65页四、改变酶最适pH值