大二下生化课件新dna

1、动物基因组DNA、总RNA的提取及含量测定吕 明，张作明吉林大学生命科学学院2014年生物化学实验II目的要求 学习和掌握从动物组织中提取核酸的原理和操作技术；了解提取DNA/RNA的几种方法，原理和优缺点；学习测定DNA/RNA含量的基本原理及具体方法。理论基础核酸是遗传信息的携带者，是生命的最基本物质，它和蛋白质是构成生物体的主要成分；按化学组成可以将核酸分成两大类： 含脱氧核糖核酸（DNA）； 含核糖核酸（RNA）； 在生物体中核酸以结合成核蛋白的形式存在，但核酸极不稳定，在较剧烈的物理、化学因素和酶的作用下都很易降解。核酸的分布：细胞核、线粒体、叶绿体、核糖体、游离。核酸分离、纯化原则

2、在生物体中核酸以结合成核蛋白的形式存在，但核酸极不稳定，在较剧烈的物理、化学因素和酶的作用下都很易降解。 保持核酸分子一级结构的完整性 意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的一级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。 排除蛋白质、脂类、糖类等其他分子的污染 ； 无杂核酸分子的污染（如纯化DNA分子时应去除RNA分子）。核酸的测定方法核酸是由糖（核糖和脱氧核糖）、磷酸以及含氮碱基（嘌呤、嘧啶）所组成的。测定核酸制品中的糖、磷、氮的含量即可计算出核酸的含量及纯度。糖：地衣酚法，二苯胺法磷酸：钼蓝反应碱基：微量凯氏定氮法，紫外吸收法，热变性法（GC含量测定），HPLC法。地

3、衣酚 (orcinol)，又称“3，5-二羟基甲苯”、“5-甲基间苯二酚”、“苔黑酚”。化学式C7H8O2.H2O。原理：当RNA与浓盐酸共热时，即可发生降解，形成核糖继而转变成糠醛，后者与地衣酚反应，在Fe3+或Cu2+催化下，生成鲜绿色复合物，反应在670nm处有最大吸收峰，RNA浓度在20 200g/mL范围内，光吸收与RNA浓度成正比。干扰：与戊糖均有反应，DNA及其它干扰物也能给出类似颜色，故测定前尽量去除。地衣酚试剂要使用前配制。地衣酚法测定RNA含量（本次试验）RNA 含量测定 管号试剂 123456789RNA标准溶液（100ug/ml）00.61.21.82.43.0000蒸

4、馏水3.02.41.81.20.602.92.82.7地衣酚试剂3.03.03.03.03.03.03.03.03.0RNA待测液0.10.20.3摇匀，100摄氏度水浴保温25min，670nm处测量OD值OD670RNA含量（ug）060120180240300二苯胺法测定DNA含量-本实验原理：DNA分子中的2-脱氧核糖在酸性环境中变成-羟基-酮基戊醛，与二苯胺试剂作用生成蓝色化合物（max=595nm）。DNA在40 400微克范围内，光吸收值与DNA的浓度成正比。乙醛可增加二苯胺法测定DNA的发色量，又可减少脱氧木糖和阿拉伯糖的干扰，能显著提高测定的灵敏度。样品中含有少量RNA并不影

5、响测定，但因蛋白质、多种糖类及其衍生物、芳香醛、羟基醛等能与二苯胺反应形成有色化合物，故能干扰DNA定理。DNA含量测定1、DNA标准曲线的制定 6支试管，依次加入0、0.4、0.8、1.0、1.2、1.6和2.0mL DNA标准溶液。添加蒸馏水，使之都成为2mL。然后各加入4mL 二苯胺试剂，混匀。于60恒温水浴中保温1h，冷却后于595nm处进行比色测定。以DNA量为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。 2、制品的测定 取2支试管，各加0.3ml、0.6ml 待测液，加水至2mL（内含DNA应在标准曲线的可范围之内）和4mL 二苯胺试剂，摇匀。其余操作同标准曲线的制作。 3、根据测得的

6、光吸收值，从标准曲线待测上查出相应该光吸收值DNA的含量. 管号试剂 123456789DNA标准溶液（200ug/ml）00.40.81.01.21.62.000蒸馏水2.01.61.21.00.80.401.71.4二苯胺试剂4.04.04.04.04.04.04.04.04.0DNA待测液00000000.30.6摇匀，60摄氏度水浴保温60min，595nm处测量OD值OD595DNA含量（ug）080160200240320400DNA 含量测定磷的测定-钼蓝反应RNA含磷质量分数为9.0%；DNA含磷质量分数为9.2%，故测得磷的量，即可求得核酸量。 生物有机磷材料中有时含有无机磷

7、杂质，故用定磷法来测定该有机磷物质的量时，必须分别测定该样品的总磷量，即样品经过消化以后所测得的含磷量，以及该样品的无机磷含量，即样品未经消化直接测得的含磷量。将总磷量减去无机磷才是该有机磷物质的含磷量。 原理：无机磷在酸性条件下，与钼酸盐（常用钼酸铵或钼酸钠）反应生成磷钼酸盐络合物。用还原剂处理，磷钼酸盐络合物被还原生成钼蓝，在660nm处有最大光吸收峰。在一定浓度范围内，颜色的深浅与磷含量成正比关系。 紫外吸收法测定核酸的含量及纯度嘌呤和嘧啶环的共轭双键系统决定了其具有吸收紫外光的特性，其吸收峰为260 nmDNA: 0.020 ug-1mlRNA: 0.022 ug-1mlDNA: 26

8、0/280=1.8RNA: 260/280=2.0260/280比值与pH有关，在酸性条件下，比值降低0.2-0.3，碱性条件下，增加0.2-0.3与碱基的组成相关。 将样品配制成含5 50g/mL核酸的溶液，于紫外分光光度计上测定260nm吸收值（使用石英比色杯），计算核酸浓度： 核酸浓度（g/mL）=式中：O.D260为260nm波长处吸收值；L为比色杯的厚度；E260nm为每毫升溶液内含1微克核酸的光吸收值，DNA为0.020，RNA为0.022； 上述样品于于紫外分光光度计上测定280nm吸收值。核酸纯度： O.D260/ O.D280 稀释倍数紫外吸收法测定核酸浓度与纯度-选作DNA

9、碱基比例的测定-测“GC比” (G+C ) mol% = （G+C ）/（A+T+ G+C ） 100% 分类学上，用G+C占全部碱基的克分子百分数来表示各类生物的DNA碱基组成特征。 DNA碱基组成是各种生物的一个稳定特征，即使个别基因突变，碱基组成也不会发生明显变化。热变性法浮力密度法高效液相色谱法注意：在低温下进行操作；减少物理因素对核酸的机械剪切力；防止过酸、过碱引起核酸降解，控制pH值范围（pH值5-9），并要保持一定离子强度；防止核酸的生物降解； 细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。因此，所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂，

10、如柠檬酸盐、氟化物、乙二胺四乙酸盐（EDTA）。 进行核酸分离时最好新鲜生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料贮存于液氮中或-70冰箱中。1、RNA的提取与测定RNA广泛存在啤酒酵母，面包酵母，酒精酵母和各种动物组织中。常见方法（依据RNA的种类和来源）： 苯酚法（实验室最常用的方法） 去污剂法 盐酸胍法苯酚法：组织匀浆后用苯酚处理离心，RNA即溶于上层被苯酚饱 和的水相中， DNA和蛋白质则留在苯酚层中，向水相加冷乙醇后， RNA即以白色絮状沉淀析出。优点：较好除去DNA和蛋白质，且获得生物活性的RNA。工业提取RNA的方法酵母细胞富含RNA，是工业上提取RNA的主要原料。工业上制

11、备RNA多选用低成本、适于大规模操作的浓盐法或稀碱法。这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备单核苷酸的原料，其工艺较简单。浓盐法：使用10氯化钠的溶液，同时在90摄氏度热处理3-4小时，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。经冷却，离心后上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法：使用0.2氢氧化钠裂解酵母，然后用酸中和，除去蛋白和菌体，上清液用乙醇沉淀RNA，或调体系pH值至RNA的等电点PI 2.5 ，沉淀目的样品。工业提取RNA的方法原理：动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白（DNP）可溶于水或浓盐溶液（如1mol/L氯化钠），但在0.14mol/L氯化钠盐溶液中溶解度最低，而核酸核

12、蛋白（RNP）则在0.14mol/L氯化钠中溶解度最大，利用这一性质可将其分开。方法：先用组织捣碎机将动物肝脏制成组织匀浆，再用0.14mol/L 氯化钠溶液把细胞中的 RNP 提取出来，最后用酚将RNA和蛋白质分开。本实验提取RNA的原理及方法RNA 提取匀浆：称取（3克？）牛肝剪碎，加20mL 0.14mol/L氯化钠溶液10000r/min左右匀浆1分钟左右；离心：匀浆后4摄氏度下，溶液离心8000 r/min（RCF？）离心7分钟，量取上清液（体积？），沉淀物留做提取DNA（质量？）；除杂质：于上清液中加入等体积80苯酚溶液（操作注意），搅拌充分混合10-15分钟，置冰箱冷却静止10-

13、15分钟，离心取含有RNA上层水相（颜色？），弃下层酚相（颜色？）（操作注意）；沉淀RNA：取上层水相含RNA溶液（体积？），加入2倍体积95冷乙醇，搅拌（操作注意），充分混合，置冰箱中冷却(约10-15分钟)，至出现白色絮状物RNA，8000r/min 离心7分钟，取沉淀物；溶解：用少量去离子水（约2毫升）溶解沉淀物，用以测定其含量。试剂和器材材料：牛肝试剂：0.14mol/L 氯化钠标准RNA溶液：100g/mL地衣酚（3,5-二羟基甲苯）试剂 （现用现配）80苯酚溶液95乙醇器材：组织捣碎机、离心机、分光光度计、烧杯、量筒等思考题RNA 提取方法有几种？有什么优缺点？RNA 提取过程中应

14、注意什么？DNA的提取及含量测定在动植物中，小牛胸腺、动物肝脏、鱼类精子，植物种子的胚中都含有丰富的DNA；微生物中，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大肠肝菌含9%10%。本实验：将沉淀物溶解于生理盐水，加入去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）溶液，使DNA与蛋白质分离开。加入固体氯化钠使其浓度达到1mol/L，使DNA溶解。加氯仿-异戊醇去除蛋白质，也可重复该步操作得较纯DNA。最后用95%乙醇沉淀DNA。去除蛋白的常用方法变性剂法：用SDS等去污剂使蛋白质变性，可以直接从生物材料中提取DNA；苯酚法：用含水的酚溶液沉淀蛋白质和DNA，分层、离心。因蛋白变性，抑制了核酸酶活性，并且操作过程比较缓和

15、，可以得到较好的DNA制品；氯仿法：用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白，使乳化，离心除蛋白，DNA在上层水相，用乙醇沉淀上层，可将DNA沉淀出来。DNA的提取溶解：将离心后除去RNA的沉淀(质量？)，用30ml生理盐水溶解，充分搅拌后，匀浆一次。加4毫升10SDS溶液，使溶液的SDS浓度达到1左右，边加边搅拌(溶液变得粘稠并略透明)，放置60 水浴保温10分钟（不停搅拌），冷却。加固体氯化钠（质量?），使溶液氯化钠浓度达到1mol/L，充分搅拌10分钟（体积？）；除杂质：加等体积氯仿-异戊醇混合液，充分震荡10分钟， 8000 r/min离心7分钟，取上层液量好体积，倒入烧杯中（离心管）（现象？

16、），加同体积的氯仿-异戊醇混合液，重复上次操作（现象？）。直至界面不出现蛋白凝胶为止；沉淀：准确量取上清液体积， (1/10体积3mol/L NaAC溶液), 加2倍体积95冷乙醇，搅拌后，置冰箱静止冷却，待有白色丝状物出现，约10-15分钟，离心8000 r/min离心7分钟，得白色沉淀（质量？）；溶解：将沉淀物用0.1mol/L NaOH约10毫升溶解。试剂和器材试剂：生理盐水10SDS氯化钠95乙醇氯仿-异戊醇混合液DNA标准溶液：用0.01mol/L NaOH配成200g/mL溶液二苯胺试剂（现用现配）器材：恒温水浴、分光光度计、移液管等思考题二苯胺法测定DNA，为什么加乙醛，作用是什

17、么？除杂质常用那些方法？DNA浓度测定与RNA浓度测定实验中，核酸样品分别用什么溶解？显色反应时，标准曲线组各样品的pH值是否相同？按照实验操作流程图，说明每一步操作的实验目的、现象、原理和进一步操作的依据。工 艺 图3g肝脏 + 20mL0.14mol/L 氯化钠 匀浆, 1min 离心 8000r/min, 7min 等体积80苯酚搅拌10-20min，冰箱静置30min8000rn/min，7min上清RNA、多糖沉淀DNA、蛋白加2倍体积95冷乙醇冰箱至出现白色沉淀离心沉 淀离心冰箱至出现白色沉淀加2倍体积95冷乙醇等体积氯仿/异戊醇，震荡10min/离心加氯化钠至1mol/L，搅拌10min4ml 10SDS，60，10min30ml生理盐水溶解上 清DNARNA注意事项RNA最终用2ml去离子水溶解，加样量不变；DNA测定，加样量改为0.3ml、0.6ml组织捣碎机的使用；苯酚、氯仿加入速度、有腐蚀性；沉淀和上清避免互相污染；移液管的使用；提取温度、冷却时间；二苯胺反应物及时清