14基因工程菌的发酵-第十三章基因工程菌的发酵

1、第十三章 基因工程菌的发酵近年来，重组DNA技术(基因工程)已开始由实验室走向工业生产，走向实用。它不仅为我们提供了一种极为有效的菌种改良技术和手段，也为攻克医学上的疑难杂症癌、遗传病及艾滋病的深入研究和最后的治愈提供了可能；为农业的第三次革命提供了基础；为深入探索生命的奥秘提供了有力的手段。现在由工程菌产生的珍稀药物，如胰岛素、干扰素、人生长激素、乙肝表面抗原等等部已先后面市，基因工程不仅保证了这些药物的来源，而且可使成本大大下降。但是从许多研究中发现，工程菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，因而工程菌不稳定性的解决已日益受到重视并成为基因工程这一高技术成就转化为生产力的关键之一。

2、第一节工程菌的来源和应用一、何谓谓基因工工程基因工程程（gennetiic eengiineeerinng）是是指在基基因水平平上，采采用与工工程设计计十分类类似的方方法，根根据人们们的意愿愿，主要要是在体体外进行行基因切切割、拼拼接和重重新组合合，再转转入生物物体内，产生出出人们所所期望的的产物，或创造造出具有有新的遗遗传特征征的生物物类型，并能使使之稳定定地遗传传给后代代。基因工程程的核心心技术是是DNAA的重组组技术。重组即即利用供供体生物物的遗传传物质或或人工合合成的基基因，经经过体外外或离体体的限制制酶切割割后与适适当的载载体连接接起来形形成重组组DNAA分子，然后在在将重组组DNA

3、A分子导导入到受受体细胞胞或受体体生物构构建转基基因生物物，该种种生物就就可以按按人类事事先设计计好的蓝蓝图表现现出另外外一种生生物的某某种性状状。除DDNA重重组技术术外，基基因工程程还应包包括基因因的表达达技术，基因的的突变技技术，基基因的导导入技术术等。基因工程程一般分分为4个步骤骤：一是取得得符合人人们要求求的DNNA片段段，这种种DNAA片段被被称为“目的基基因”；二是是将目的的基因与与质粒或或病毒DDNA连连接成重重组 DDNA；三是把把重组DDNA引引入某种种细胞；四是把把目的基基因能表表达的受受体细胞胞挑选出出来。 DNAA 分子子很小，其直径径只有220埃，约相当当于五百百万

4、分之之一厘米米，在它它们身上上进行“手术”是非常常困难的的，因此此基因工工程实际际上是一一种“超级显显微工程程”，对 DDNA的的切割、缝合与与转运，必须有有特殊的的工具。要要把目的的基因从从供体 DNAA长链中中准确地地剪切下下来，可可不是一一件容易易的事。19668年，沃纳阿尔伯伯博士、丹尼尔尔内森斯斯博士和和汉密尔尔史密斯斯博士第第一次从从大肠杆杆菌中提提取出了了限制性性内切酶酶，它能能够在DDNA上上寻找特特定的“切点”，认准准后将DDNA分分子的双双链交错错地切断断。人们们把这种种限制性性内切酶酶称为“分子剪剪刀”。这种种“分子剪剪刀”可以完完整地切切下个别别基因。自700年代以以来

5、，人人们已经经分离提提取了 4000多种“分子剪剪刀”。有了了形形色色色的“分子剪剪刀”，人们们就可以以随心所所欲地进进行DNNA分子子长链的的切割了了。DNAA的分子子链被切切开后，还得缝缝接起来来以完成成基因的的拼接。19776年，科学们们在5个实验验室里几几乎同时时发现并并提取出出一种酶酶，这种种酶可以以将两个个DNAA片段连连接起来来，修复复好DNNA链的的断裂口口。19974年年以后，科学界界正式肯肯定了这这一发现现，并把把这种酶酶叫作DDNA连连接酶。从此，DNAA连接酶酶就成了了名符其其实的“缝合”基因的的“分子针针线”。只要要在用同同一种“分子剪剪刀”剪切的的两种 DNAA碎片

6、中中加上“分子针针线”，就会会把两种种DNAA片段重重新连接接起来。把“拼接”好的 DDNA分分子运送送到受体体细胞中中去，必必须寻找找一种分分子小、能自由由进出细细胞，而而且在装装载了外外来的 DNAA片段后后仍能照照样复制制的运载载体。理理想的运运载体是是质粒，因为质质粒能自自由进出出细菌细细胞，应应当用“分子剪剪刀”把它切切开，再再给它安安装上一一段外来来的 DDNA片片段后，它依然然如故地地能自我我复制。有了限限制性内内切酶、连接酶酶及运载载体，进进行基因因工程就就可以如如愿以偿偿了。运运载体将将目的基基因运到到受体细细胞是基基因工程程的最后后一步，目的基基因的导导入过程程是肉眼眼看不

7、到到的。因因此，要要知道导导入是否否成功，事先应应找到特特定的标标志。例例如我们们用一种种经过改改造的抗抗四环素素质粒PPSC1100作作载体，将一种种基因移移入自身身无抗性性的大肠肠杆菌时时，如果果基因移移入后大大肠杆菌菌不能被被四环素素杀死，就说明明转入获获得成功功了。二、工程程菌的获获得1，确定定目的产产物。2，找出出产该产产物的细细胞。3，将细细胞破碎碎后提纯纯出全部部信使RRNA。这些信信使中包包含了该该细胞内内表达的的所有蛋蛋白质的的合成信信息。4，利用用基因扩扩增技术术（PCCR），找出所所需的目目的基因因。5，将目目的基因因连接到到设计好好的质粒粒载体，形成了了重组DDNA分分

8、子。6，将重重组后DDNA分分子引入入到受体体细胞内内，然后后选择合合适的培培养条件件使细胞胞繁殖。根据选选择性标标记，从从菌落中中筛选出出目的基基因的重重组(工程)菌。三、工程程菌应具具备的条条件1，发酵酵产品是是高浓度度、高转转化率和和高产率率的，同同时是分分泌型菌菌株。2，菌株株能利用用常用的的碳源，并可进进行连续续发酵。3，菌株株不是致致病株，也不产产内毒素素。4，代谢谢控制容容易进行行。5，能进进行适当当的DNNA重组组，并且且稳定，重组的的DNAA不易脱脱落。四、工程程菌的应应用1，基因因药物例如，红红细胞生生成素、胰岛素素、干优优素、乙乙肝疫苗苗、生长长激素和和粒细胞胞巨噬细细胞

9、集落落刺激因因子等。2，其它它发酵产产品例如酶制制剂、氨氨基酸（苏氨酸酸、色氨氨酸）、抗生素素等。第二节工工程菌的的培养就生产流流程而言言，从发发酵到分分离、纯纯化目标标产物，工程菌菌和常规规微生物物并无太太多的差差异。但但工程菌菌在保存存过程中中及发酵酵生产过过程中表表现出不不稳定性性，以及及安全性性等问题题，使得得工程菌菌的培养养有着自自身所特特有的特特点。一、安全全问题关于基因因工程的的社会问问题，必必须提到到它的潜潜在危险险性。经经过重组组的菌和和质粒一一旦用于于，工业业化生产产，就不不可避免免地进入入自然界界。这些些菌能间间接地危危害人体体健康，使治疗疗药物失失去效用用，污染染环境等

10、等。因此此，安全全问题是是极其重重要的。 19774年，提出了了DNAA重组实实验具有有潜在生生物危险险性的问问题。后后来，美美、日等等国都制制定了有有关DNNA重组组实验的的准则，即在试试管内用用酶等构构建异种种DNAA的重组组分子，并用它它转入活活细胞中中的实验验，以及及使用重重组体的的实验应应遵循的的规程。其目的的是保证证实验的的安全和和推动重重组DNNA的研研究。这这些准则则参照了了防止病病原微生生物污染染的措施施，以及及根据对对实验安安全度的的评定，采用物物理密封封(P11P44)和生生物学密密封(BB1和BB2)两两种方法法。 物理密密封是将将重组菌菌封闭于于设备内内，以防防止传染

11、染给实验验人员和和向外界界扩散。实验规规模在220L以以下时，物理密密封由密密封设施施、实验验室设计计和实验验注意事事项组成成。密封封程度分分为P11、P22、P33和P44级，数数字越大大，密封封水平越越高。生生物学密密封要求求用只有有在特殊殊培养条条件下才才能生存存的宿主主，同时时用不能能转移至至其它活活细胞的的载体，通过这这样组合合的宿主主载体系系统，可可以防止止重组菌菌向外扩扩散。按按密封程程度分BB1和BB2级，B2级级的密封封要求最最严格。 企业中中进行重重组菌培培养时的的设备标标准有LLS-11和LSS-2。LS-2相当当严格，工业生生产起码码应在LLS-11的设备备标准下下培养

12、。LS-1标准准要点是是：(11)使用用防止重重组菌体体外漏，能在密密闭状态态下进行行内部灭灭菌的培培养装置置；(22)培养养装置的的排气由由除菌器器排出；(3)使用易易产气溶溶胶的设设备时，要安装装可收集集气溶胶胶的安全全箱等。设计用用于基因因重组菌菌的培养养装置时时，不仅仅要考虑虑外部杂杂菌的侵侵入，还还要防止止重组菌菌的外漏漏。此外外，培养养后的菌菌体分离离、破碎碎等处理理也必须须在安全全柜内进进行，或或是采用用密闭型型的设备备。二、基因因工程细细胞培养养特点 前已述述及，基基因工程程细胞培培养过程程与培养养方式与与天然细细胞培养养过程或或方式基基本致。但但亦有其其自身持持点。实实践表明

13、明，基因因工程细细胞工业业化培养养中，产产物的产产率往往往比实验验室培养养规模为为低。其其原因主主要与基基因工程程细胞特特点有关关，首先先基因工工程细胞胞的生长长速率及及表达率率与其所所载外源源DNAA的稳定定性及产产物分泌泌过程有有关，其其中重组组DNAA的稳定定性尤为为重要，重组DDNA在在宿主内内表达方方式有两两种，其其一是游游离表达达方式、其二是是结合表表达方式式。因此此，基因因工程细细胞培养养过程，重组DDNA的的丢失方方式亦有有两种，其一是是细胞培培养过程程，由于于回复突突变或分分配作用用致使DDNA丢丢失称称为脱落落性不稳稳定，其其二是重重组DNNA中编编码的结结构基因因在宿主主

14、内发生生再重组组过程产产生突变变，不再再表达目目的产物物，此称称加结构构性不稳稳定。其其次为提提高基因因工程细细胞表达达效率，需采取取适当措措施，提提高重组组DNAA在宿主主细胞内内的拷贝贝数及促促进表达达产物自自细胞内内向细胞胞外分泌泌。此外外，基因因工程细细胞的原原宿主通通常是某某些培养养物质(如某种种氨基酸酸或维生生素等)的缺陷陷型，有有些基因因工程细细胞生产产过程亦亦产生某某些抑制制细胞生生长的代代谢物。由此，在培养养工程中中应考虑虑控制培培养液营营养成分分及其浓浓度，同同时采取取措施，消除抑抑制细胞胞生长的的代谢物物，以保保证细胞胞正常生生长。由由此可见见，在基基因工程程细胞培培养过

15、程程，除般培养养条件外外，必需需考虑基基因工程程细胞的的自身特特点，确确定最佳佳培养条条件。三、基因因工程细细胞的培培养 前已述述及，基基因工程程细胞的的培养过过程与一一般需氧氧细胞培培养基本本一致，同时培培养方式式亦无差差异，可可采用各各种分批批培养方方式，亦亦可采用用连续培培养、半半连续培培养及透透析培养养等方式式。至于于影响基基因工程程细胞培培养的细细胞生物物量得率率与产物物量的因因素及有有关参数数。亦可可参照普普通细胞胞相应培培养方式式求得。 目前关关于动植植物基因因工程细细胞培养养工程的的研究刚刚刚起步步，有待待进步发展展。这里里仅对基基因工程程菌的营营养控制制、质粒粒稳定性性、重组

16、组质粒拷拷贝数的的控制及及表达效效率作简简单讨论论。1，底物物浓度的的控制在基因工工程茵培培养过程程，至少少要遵循循PI级物理理防护的的规定，因此必必需进行行菌体的的高密度度培养。普通EEcooli培培养时最最高干重重菌体收收率可达达125，酿酒酵酵母可得得14.5%，浙枯草草杆菌仅仅可得22%左右右。根据据这些结结果采用用枯草杆杆菌不太太合适，除非其其具有产产物的高高效分泌泌系统。 从生物物安全性性考虑，培养的的基因工工程菌通通常是维维生素或或氨基酸酸的营养养缺陷型型突变株株。培养养过程细细胞对维维生素需需求量甚甚微，在在培养开开始即加加入必需需量对细细胞生长长并无影影响，但但培养一一开始即

17、即加入足足够量氨氨基酸则则可能因因氨基酸酸浓度过过大而抑抑制细胞胞生长。在此情情况下，可采取取培养过过程中，在调节节pH值值同时补补加氨基基酸混合合物和葡葡萄糖的的方法，以便培培养过程程葡萄糖糖及氨基基酸浓度度的基本本恒定，从而实实现高密密度培养养，如EEcooli C6000株培培养时可可获得66干菌菌体。但但菌体对对葡萄糖糖及氨基基酸的收收率因培培养条件件而异，如以葡葡萄糖及及分别用用苏氨酸酸、亮氨氨酸、组组氨酸及及色氨酸酸为底物物时，则则平均每每克底物物所获干干菌体量量分别为为0.33、2.5、115、440及440g 。按每每克干菌菌体成本本计，应应用苏氨氨酸成本本最高，故应避避免应用

18、用苏氨酸酸缺陷型型菌株为为宿主，最好选选用维生生素缺陷陷型菌株株为宿主主。2、质粒粒稳定性性重组质粒粒上通常常载有AApr基因，获得该该类重组组质粒的的基因工工程菌在在含氨苄苄青霉素素培养液液中可以以生长，而非基基因工程程菌不能能生长。但在基基因工程程菌高密密度培养养时，外外加的抗抗生素AAP易于失失活，影影响培养养。为此此考虑采采用抗生生素依赖赖性变异异法替代代抗生素素添加法法。其方方法是通通过诱变变使宿主主成为某某抗生素素依赖性性突变株株(如链链霉素依依赖性SSmd)。只有在在Sm存在下下宿主才才能生长长，但重重组质粒粒上含有有Sm非依赖赖性(SSmidd)基因因，将重重组质粒粒导入宿宿主

19、细胞胞后，所所获克隆隆菌可在在不含抗抗生素培培养基中中生长，而丢失失质粒菌菌株却不不能生长长。此法法很有实实用价值值，但缺缺点是宿宿主细胞胞易产生生回复突突变，造造成培养养工程复复杂化，产物产产率下降降。 为考察察质粒稳稳定性，在此引引入质粒粒保持率率Fn的概念念，Fnn表示分分批培养养中细胞胞分裂nn次后，培养液液中基因因工程细细胞数与与总细胞胞数的比比值，即即假定在分分批培养养过程中中，细胞胞在对数数生长期期每次分分裂时，其质粒粒丢失率率为P，则Fnn为：式中 -质粒粒丢失菌菌株与质质粒保持持率菌株株的比值值； nn-细胞胞分裂次次数理论上基基因工程程菌载荷荷外源性性基因，培养过过程细胞胞

20、大量合合成外源源性产物物，其负负荷大于于质粒丢丢失菌株株，故基基因工程程菌株比比生长速速率通常较较质拉丢丢失菌株株小，当当然亦有有变化不不大者。根据以以上方程程计算结结果，FFn变化情情况如图图7-220所示示。由图7-20可可知假假定P1%，当0时时，表明明质粒丢丢失菌株株不能生生长，培培养处于于最理想想的稳定定状态，亦为质质粒最稳稳定状态态，此时时Fn接近于于1.00；但在在无选择择压力下下，值越大大，Fnn越低，即质粒粒稳定性性越差。 在基因因工程细细胞的连连续培养养方式中中，若无无选择压压力，迪迪常不能能得到恒恒定的稳稳定状态态。而在在有选择择压力下下，则可可获得稳稳定状态态。但是是培

21、养基基也与质质粒稳定定性有关关，采用用天然培培养基培培产时质质粒稳定定件较用用合成培培养基为为高，在在天然培培养基中中即使无无选择压压力亦可可保持质质粒的稳稳定性，因此，用天然然培养基基进行连连续培养养是获得得质粒稳稳定性的的良好方方法。3，表达达效率及及质粒拷拷贝数控控制在基因工工程细胞胞培养工工程中，表达效效率与质质粒拷贝贝数有关关。在质质粒稳定定基础上上，应尽尽可能提提高细胞胞内质粒粒拷贝数数。在工工业生产产中易于于操作的的方法是是在培养养的不同同阶段，采用不不同培养养温度达达到提高高拷贝数数目的，在前培培养阶段段采用低低温，以以减少细细胞负荷荷，此时时拷贝数数较低，而比生生长速率率升高

22、，在主培培养中途途升高温温度，质质粒拷贝贝数增加加，目的的基因产产量提高高。如图图7-221所示示，在225下，培培养含有有穿梭质质粒pCCP3的Eccolii C6600/pCII8577至浊度度为5。再将培培养温度度提高至至37，则质质粒拷贝贝数增加加，基因因产物-内酰酰胺酶活活性增加加37倍倍左右，但Fnn急剧下下降。此此外，利利用噬菌体体PL启动子子的温度度敏感性性，采用用二级连连续培养养方式，第1罐罐于低温温下培养养以降低低表达效效率，第第2罐高高温培养养，对提提高表达达效率亦亦是有效效的。 此外，当质粒粒拷贝数数与某些些化合物物有关时时，亦可可采取添添加或去去除相应应化合物物的双阶

23、阶段连续续过滤培培养法以以提高拷拷贝数和和表达效效率。如如用含有有在色氨氨酸启动动子下游游接有-半乳乳糖苷酶酶基因的的重组质质粒pMMCT998的基基因工程程菌进行行单级连连续培养养，并结结合0.2m孔径径陶瓷过过滤器装装置(图图7-222)，开始培培养液含含色氨酸酸，表达达效率低低，当生生长浊度度达到110时，进行交交叉流动动过滤，且供给给不含色色氨酸料料液，结结果如图图7-223所示示。过滤滤达155minn后培养养液中已已测不出出色氨酸酸，表达达效率增增加，-半乳乳糖苷酶酶活力剧剧增。最最终浊度度达1550(相相当于含含6%干干细胞)，半乳糖糖苷酶约约占总蛋蛋白量88%。 由此可可知，在

24、在基因工工程细胞胞培养工工程中，需根据据其固有有特点和和具体情情况，采采取相应应措施、提高质质粒稳定定性，增增加质粒粒拷贝数数，实现现培养条条件优化化，提高高表达效效率。第三节工工程菌分分批培养养动力学学对于质粒粒脱落性性不稳定定，细胞胞在分裂裂时丢失失质粒的的概率为为p，则所以对于底物物对于产物物第四节培培养装置置与产物物的提取取工程菌的的培养与与普通微微生物的的培养方方法类似似。在进进行以工工业化为为目的的的DNAA重组实实验，以以及为生生产异种种基因产产物而培培养重组组菌时，当然应应采用简简便易行行的培养养系统。现在多多半使用用大肠杆杆菌为宿宿主，而而在一般般的通气气搅拌罐罐中大肠肠杆菌

25、能能生长良良好。一、培养养装置 作为基基因重组组体的培培养装置置，与一一直沿用用的通气气搅拌培培养罐要要有区别别，即不不仅要防防止外部部微生物物侵入罐罐内，还还必须采采用不使使培养物物外漏的的培养装装置。按按实验准准则，可可把这类类密闭型型通气搅搅拌式培培养罐划划分为操操作液量量20LL以上和和20LL以下两两种。 现今使使用的微微生物培培养装置置，按其其灭菌法法又可分分两类。一是在在高压灭灭菌器中中进行培培养基及及培养罐罐的灭菌菌，罐本本身通常常是玻璃璃制的，容量在在10LL以下的的居多；另一类类是200L以上上的培养养罐，一一般为不不锈钢制制品，多多采用通通新鲜蒸蒸气进行行灭菌。前者是是可

26、移动动的台式式，罐本本身不能能承受高高压；后后者，蒸蒸汽、空空气等供供给是用用固定管管道连接接的，一一般不能能移动；这两类类罐要充充分考虑虑不使微微生物由由罐外进进入罐内内的问题题，但并并不一定定要解决决防止罐罐内微生生物的外外漏问题题。 因此，采用高高压灭菌菌器灭菌菌的小型型培养罐罐时应在在安全柜柜内运转转。但培培养罐稍稍大，该该法就难难以使用用了。二、基因因重组菌菌外漏的的防范 首先应应了解培培养微生生物在普普通通气气搅拌罐罐中可能能发生外外漏的部部位和操操作。归归纳起来来有：(1)排排气，(2)机机械密封封，(33)接种种，(44)取样样，(55)培养养后的灭灭菌(通通入湿热热蒸气)，(

27、66) 排排液(输输至下一一工序)。针对对这些均均应采取取一些措措施以防防菌体外外漏。现现分别说说明如下下。 1，排排气 排出的的气中含含有大量量气溶胶胶，在激激烈起泡泡的培养养时，培培养液呈呈泡沫状状。它们们从排气气口向外外排出，重组菌菌也容易易随之外外漏。 以往培培养病原原菌时；为防止止菌体外外流，采采取加药药剂槽的的方法，但效果果如何尚尚有疑问问。有人人试验证证明，排排气中的的微生物物数量随随着培养养液中菌菌体浓度度和通风风速度等等而变化化。用55L培养养罐(装装液量22.5LL)，以以搅拌速速度4000r/minn，通气气速度11：1(VVMM)，即即2.55L/mmin(换算成成罐内

28、通通气速度度为111cm/minn)来培培养大肠肠杆菌，发现每每毫升培培养液中中含1009个菌体体，每小小时有11504000个菌随随气排出出；而培培养酿酒酒酵母时时，每小小时从每每毫升含含1088个菌体体培养液液的排气气中检出出3070个个。由此此可见，虽然培培养液中中菌体浓浓度相差差很大，但大肠肠杆菌和和酵母菌菌仍以几几乎相同同程度从从排气中中漏出，并不取取决于菌菌体个体体的大小小。再有有，提高高通气速速度时，单位体体积的排排气中，大肠杆杆菌和酵酵母菌菌菌数都增增加，通通气速度度与漏菌菌数之间间也密切切相关。总之，排气过过程中含含有相当当多的菌菌。为此此，在通通用通气气搅拌型型培养罐罐上安

29、装装排气鼓鼓泡器，以防止止激烈起起泡时泡泡沫直接接外溢和和外部微微生物侵侵入污染染，同时时还能肉肉眼观察察通气状状态等(图111-8)。气体体通过排排气管到到鼓泡瓶瓶，再通通过膜滤滤器。进进而考察察了该排排气鼓泡泡瓶中加加入药剂剂(如22moll/L NaOOH)的的效果。 另外，为了解解加热能能否对排排气灭菌菌，进行行了与上上述类似似的实验验。图111-99的结果果表明。用电热热器对排排气进行行加热时时，在电电热器出出口处的的排气温温度被控控制在2200C左右右。电热热器之后后附有冷冷凝器，旨在使使高温的的排气冷冷却，以以防膜滤滤器烧毁毁。 图111-8和和图111-9的的结果如如表111-

30、4所所示。表表中数字字为培养养开始启启12hh中在膜膜滤器上上捕集到到的活菌菌数。结结果表明明，排气气仅通过过药剂还还不能完完全灭菌菌。使用用药剂时时若能在在排气鼓鼓泡瓶内内进行搅搅拌、消消泡的话话，是会会有效果果的。用用电热器器将排气气加热至至2000C 时时，均末末在膜滤滤器上检检出大肠肠杆菌和和酵母菌菌。 图111-100是基因因重组菌菌培养装装置中普普遍采用用的排气气除菌系系统。为为减少培培养液的的蒸发量量和降低低排气的的相对湿湿度。在在罐排气气口外安安装冷却却冷凝器器，其后后才是加加热器，排气气气体经此此加热至至6080C。相相对湿度度降低可可预防滤滤器上凝凝结水汽汽。除菌菌滤器与与

31、培养罐罐空气入入口处的的相同。排气中的的微生物物（个）菌种鼓泡瓶碱电热器大肠杆菌菌酿酒酵母母980716114000除菌滤器器有经多多孔填料料除菌的的膜型滤滤器和深深度型滤滤器。后后者主要要用于气气体过滤滤，其原原理与膜膜滤器不不同，无无筛网的的效果，而是通通过静电电吸附、惯性冲冲撞等作作用捕集集气体中中的粒子子。无论论使用哪哪种类型型的滤器器，都应应对排气气进行去去湿处理理。使用用膜滤器器时，因因滤器表表面凝结结水汽，压力损损失骤增增，深度度型滤器器除菌效效率也会会因水汽汽凝结而而下降。膜滤器器原来多多用于过过滤液体体，通过过流水性性滤器的的开发，也能应应用于气气体过滤滤了。 2，机机械密封

32、封 通气搅搅拌培养养罐中贯贯穿罐的的搅拌轴轴须与传传动部连连接。作作为这部部分的轴轴封使用用的是机机械密封封，有单单机械密密封和双双机械密密封之分分。前者者由单密密封面将将罐与外外界隔开开。此密密封部分分因高速速旋转产产生摩擦擦热，故故需冷却却和润滑滑。这样样一来，即便正正常运转转，培养养液也会会一点一一点地渗渗入密封封面，很很有可能能经此流流出。同同时，灭灭菌时的的热膨胀胀差也会会使流出出量增加加。这是是培养结结束后灭灭菌时最最易外漏漏的所在在。还有有，机械械密封受受使用寿寿命所限限，在溢溢漏发生生前就应应定期更更换。所所以单机机械密封封的培养养罐不宜宜用于基基因重组组菌的培培养。 双机械械

33、密封是是用高于于罐内压压的压力力，将贮贮存于另另一润滑滑液槽中中的无菌菌水压入入机械密密封部，用作轴轴封润滑滑液。这这时，上上、下两两部分即即使有一一部分的的密封液液渗漏，培养液液也几乎乎无外漏漏危险。但上、下两方方同时溢溢漏时，培养液液亦有可可能外漏漏了。因因此，问问题在于于搅拌轴轴是由罐罐的上部部还是下下部通入入。从培培养装置置的使用用优点及及搅拌轴轴长度等等角度看看，用下下搅拌为为好。但但若考虑虑培养液液外漏的的情况，培养基基因重组组菌时，以用上上部搅拌拌的双机机械密封封为好。 用磁力力方法改改变搅拌拌动力的的传动就就不必担担心机械械密封的的外漏了了。100L以下下的培养养装置以以往一直

34、直是用磁磁力进行行动力传传动的，但罐一一大，会会出现磁磁力不足足、轴承承磨损等等问题。目前大大至900L培养养罐，已已能用强强磁力进进行动力力传动。现时，基因重重组菌的的培养罐罐仍采用用双机械械密封的的上搅拌拌方式为为多，其其次用双双机械密密封的下下搅拌方方式。 3，取取样 普通培培养罐的的取样管管道在取取样时会会流出样样品。取取样后对对样品管管道灭菌菌时，未未灭菌的的培养液液污水被被排至排排水管内内。对此此，必须须采取措措施，如如用取样样工具进进行取样样(图111-111)。此法可可在培养养液不接接触外界界的条件件下取样样。用高高压灭菌菌器使其其灭菌或或是连接接后用蒸蒸汽灭菌菌，灭菌菌结束后

35、后将样品品从罐中中取出送送入样品品管中。取完所所需的样样品，卸卸下之前前对取样样管道再再次灭菌菌。卸下下经灭菌菌的连结结器，在在安全柜柜中卸下下样品管管。取样样中使用用的排水水管管道道与废液液灭菌贮贮罐相连连，取样样及灭菌菌时产生生的排水水一并贮贮存于罐罐内，经经灭菌后后排出。此外还还设计了了各种安安全取样样用的器器具。例例如，通通过双层层橡皮膜膜，用注注射器取取样；把把可移动动的完全全密封型型的球形形箱与取取样管连连接，在在此箱中中取样等等。但是这些些操作都都由人工工控制，操作中中难免出出错。为为了减少少操作人人员接近近工程菌菌的机会会，尽量量不用人人工操作作而采用用自动取取样装置置最为安安

36、全。图图11-12为为自动取取样装置置的流程程图。取取样方法法与人工工取样程程序大致致相同。同时，取样过过程因采采用程序序系统控控制而易易于变动动。取出出的样品品保存于于冷库内内，冷库库内的空空气经滤滤器过滤滤，内部部也可进进行灭菌菌。4，培养养后的灭灭菌培养后对对培养液液和管道道等进行行灭菌时时，一开开始流出出的末灭灭菌排水水有可能能存在活活的重组组菌。取取样、排排液的管管道中能能产生这这类排水水，因此此，一定定要另行行安装排排水管并并与废液液灭菌贮贮槽等相相连接，以便徘徘放污水水。5，接种种向罐内直直接接种种的方法法是不安安全的。简单的的安全接接种法是是将种子子瓶与培培养罐以以管相连连接后，用无菌菌空气加加压压入入的方法法。另一一种方法法是先把把种子液液在安全全柜内移移至供接接种用的的小罐内内，再将将其与培培养罐连连接，用用蒸汽对对连接部部分灭菌菌后，把把种子罐罐中的种种子液接接入培养养罐内。6，排液液培养后要要将培养养液输送送至贮罐罐等下一一道工序序，这时时也有可可能产生生气溶胶胶和重组组菌的扩扩散。安安全的方方法是在在培养开开始前就就将排液液口与下下段工序序相连接接并进行行