DB11-T375-2017水生动物检疫名录及病原检测方法

1、ICS 65.150B 50备案号:54157-2017DB11北京市地方标准DB11/T 3752017代替 DB11/T 375-2006水Th动物检疫名录及病原检测方法List of aquatic animal diseases and its detection method2017 - 03 - 22 发布2017 - 07 - 01 实施北京市质量技术监督局发 布DB11/T 3752017前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准替代DB11/T 3752006水生动物检疫名录及病原检测方法，与DB11/T 3752006相比， 除编辑性修改外主要技术变化如下

2、：修改了标准适用范围(见 1)；修改了检疫名录(见 3,2006 年版的 3)；修改了病原检测方法（见 4.2,2006 年版的 4）；删除了资料性附录 A、B、C、D、E、F、G、H、I、J（见 2006 年版的附录 A、B、C、D、E、F、G、H、I、J）；删除了结果报告单（见 2006 年版的 5）；增加了采样、抽样规格、抽样水温的规定(见 4.1)；增加了资料性附录 A“鲫造血器官坏死病诊断规程” （见附录 A）。请注意文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由北京市农业局提出并归口。本标准由北京市农业局组织实施。本标准起草单位：北京市水产技术推广站

3、。本标准主要起草人：曹欢、王姝、王小亮、王静波、曹洁、徐立蒲、那立海、贾丽、张文、王澎。本标准所代替标准的历次版本发布情况为:DB11/T 3752006。IDB11/T 3752017水Th动物检疫名录及病原检测方法范围本标准给出了水生动物检疫名录及病原检测的方法。本标准适用于水生动物检疫以及相关疫病的监测。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T15805.1鱼类检疫方法 第1部分：传染性胰脏坏死病毒(IPNV)GB/T15805.2鱼类检疫方法 第2

4、部分：传染性造血器官坏死病毒(IHNV)GB/T15805.4鱼类检疫方法 第4部分：斑点叉尾鮰病毒(CCV)GB/T15805.5鱼类检疫方法 第5部分：鲤春病毒血症病毒(SVCV)SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范SC/T7212.1鲤疱疹病毒检测方法 第1部分：锦鲤疱疹病毒SN/T2503淡水鱼中寄生虫检疫技术规范SN/T3584草鱼出血病检疫技术规范检疫名录检疫对象及其相应的检疫范围见表1。表1检疫名录序号检疫对象检疫范围1鲤春病毒血症（Spring viraemia of carp，SVC）鲤鱼、锦鲤、金鱼等鲤科鱼类2草鱼出血病（Hemorrhage disease of

5、grass carp，GCRV）青鱼、草鱼3传染 性 造 血 器官 坏死 病（ Infectious haematopoieticnecrosis ,IHN）虹鳟等冷水性鲑科鱼类4锦鲤疱疹病毒病（Koi herpesvirus disease，KHVD）鲤、锦鲤5鲫造血器官坏死病（Goldfish haematopoietic necrosis ,GFHN）金鱼、鲫6传染性胰脏坏死病（Infectious pancreatic necrosis ,IPN）虹鳟等冷水性鲑科鱼类7斑点叉尾鮰病毒病（channel catfish virus disease ,CCVD）斑点叉尾鮰8小瓜虫病（Ich

6、thyophthiriasis）淡水鱼类病原检测采样方法1DB11/T 3752017采样按照SC/T 7103的规定执行，抽样规格及抽样水温见表2。表2抽样规格及抽样水温序号检 疫 对 象抽样 规 格抽样 水 温1鲤春病毒血症苗种或成鱼10202草鱼出血病苗种或成鱼20303传染性造血器官坏死病6 月龄以下苗种8154锦鲤疱疹病毒病苗种或成鱼20305鲫造血器官坏死病苗种或成鱼15266传染性胰脏坏死病3 月龄以下苗种10147斑点叉尾鮰病毒病苗种或成鱼25308小瓜虫病苗种或成鱼1525检测方法病原检测方法见表3。表3检测方法序号检 疫 对 象检 测 方 法1鲤春病毒血症GB/T 1580

7、5.52草鱼出血病SN/T 35843传染性造血器官坏死病GB/T 15805.24锦鲤疱疹病毒病SC/T 7212.15鲫造血器官坏死病见附录 A6传染性胰脏坏死病GB/T 15805.17斑点叉尾鮰病毒病GB/T 15805.48小瓜虫病SN/T 25032DB11/T 3752017附录A（资料性附录）鲫造血器官坏死病诊断规程病原鲫造血器官坏死病毒（Goldfish haematopoietic necrosis virus，GFHNV）。样品要求水温采集样品时的水温应在1526。品种采样品种为金鱼、鲫及其杂交种。优先采集金鱼，其次为鲫鱼，及其它杂交品种。数量按照SC/T 7103 执行

8、。状态已死亡鱼样不采集。信息采集需采集金鱼、鲫及其杂交种发病情况、混养其它鱼类发病情况、采样水温等信息。临床症状及流行病学特征临床症状患金鱼造血器官坏死病的金鱼、鲫，特别是杂交种，具有下列临床症状：最显著的特征为鳃部严重充血, 濒死病鱼鳃部开始大量出血，血液不断的顺着鳃丝流到体外；体表、下颌等处分布大量点状出血点；病鱼没有生气，不吃食，在水面缓游，病情严重时由于严重贫血使得鳃明显退色，皮肤和鳃上有白色斑块，症状和锦鲤发生的锦鲤疱疹病毒病不同；将病鱼解剖后可见其肝发白，脾和肾肿大，脾上有白色结节。流行病学特征患金鱼造血器官坏死病的金鱼、鲫，特别是杂交种，具有下列流行病学特征：GFHNV 具有较高

9、的传染性，但它的感染谱较小，仅感染金鱼、鲫，特别是杂交种；该病流行的水温适宜范围为 1526，即当池塘水温自然上升至 15时，疾病开始发生，而继续上升至 26以上时，这种疾病发生率会大幅度下降；而当秋季温度开始下降，特别是降3DB11/T 3752017低到 26以下时会再次流行；该病严重时死亡率较高(可以达 90%以上)；被感染的鱼可以长期带毒。实验室检测试剂和材料水：符合GB/T 6682中一级水的规格。GFHNV阳性样品：符合国家有关规定。Taq酶：20保存，不能反复冻融或温度剧烈变化。dNTP：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10 mmoL/L。MgCl2：25 mmoL/L

10、。引物：浓度为100 pmoL/L。其序列如下：CyHV-pol-F：5-CCCAGCAACATGTGCGACGG-3；CyHV-pol-R：5-CCGTARTGAGAGTTGGCGCA-3。扩增 CyHV 1-3 型 pol 基因 362 bp 片段。引物：浓度为100 pmoL/L。其序列如下：GFHVN-F：5-CTACACGCCTCGCATCAT-3；GFHVN-R：5-CTCCACGGTCCTCATCTT-3。扩增 GFHNV DNA helicase 基因 451 bp 片段。器材和设备普通冰箱和超低温冰箱。组织研磨器。离心机和离心管。PCR扩增仪。水平电泳仪。微量移液器及吸头。紫

11、外观察灯或凝胶成像仪。样品处理取肾、脾、鳃和脑组织，成熟雌鱼还需取卵巢液。将所取样品匀浆成糊状，按1：10的最终稀释度悬于磷酸盐缓冲液或M199细胞培养液。DNA抽提CTAB+酚/氯仿/异戊醇抽提法将450L悬液放入1.5mL的离心管，再加入450L CTAB溶液并混匀，25作用2小时。在含有样品的离心管中加入600L抽提液，用力混合。12000r/min离心5min，取上层水相（约800L）。再加入700L抽提液，用力混合。12000r/min离心5min，取上层水相（约600L）。再加入预冷的1.5倍体积的无水乙醇（约900L），倒置数次混匀后，放置离心管于20下，至少8h后取出。1200

12、0r/min 离心30min，倒去上清液。将离心管倒置于吸水纸上，吸干液体。加11L DEPC水溶解后，作为PCR模板。4DB11/T 3752017DNAzol抽提法将100L悬液放入1.5ml的离心管，再加入1ml DNAzol，颠倒混匀5次，室温下静置5min，10600g（11400r/min）离心10min；吸取上清约1ml，加入0.5ml无水乙醇，颠倒混匀5次，室温下静置5min，18000g（15000r/min）离心30min；吸弃上清，加入500L 75%的乙醇清洗，18000g（15000r/min）离心5min； 吸弃乙醇，干燥5min；加入50L DEPC水（60预热）

13、，60保温5min；即为提取的DNA，作为PCR 模板。DNA提取试剂盒抽提法具体参照试剂盒说明书。DNA扩增扩增CyHV pol基因反应体系为100L：在0.2mL反应管中加入10L模板、 2.5L dNTP、10 L 氯化镁溶液、10L 10倍Taq酶缓冲液、CyHV-pol-R和CyHV-pol-F各1L、2.5U Taq酶、加DEPC水至100L。将反应管置于PCR扩增仪。反应程序：94变性5min；94变性1min、60退火1min、72 延伸1min，40次循环；72延伸10min；4保温。扩增GFHNV DNA helicase基因的反应体系为100L：在0.2mL反应管中加入1

14、0L模板、2.5 L dNTP、10L氯化镁溶液、10L 10倍Taq酶缓冲液、GFHNV-R和GFHNV-F各1L、2.5U Taq酶、加D EPC水至100L。将反应管置于PCR扩增仪。反应程序：94变性5min；94变性1min、55退火1min、72延伸1min，40次循环；72延伸10min；4保温。设立对照在6.3样品处理过程中应设立阳性样品对照、阴性样品对照、空白对照。取GFHNV阳性样品抽提核酸作为阳性对照。取正常的鱼组织抽提核酸作为阴性对照。取等体积的水代替模板作为空白对照。琼脂糖电泳用TBE电泳缓冲液，配制1.5%的琼脂糖平板（含1L/mL EB）。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将6L样品和2L上样缓冲液，按比例混匀后加入样品孔。在电泳时使用核酸分子量标准参考物作对照。5V/cm电泳约0.5h,当溴酚蓝到达底部时停止。在紫外观察灯下或用凝胶成像仪观察扩增带并判断结果。测序取362bp DNA片段PCR产物进行基因序列测定，将测序结果与GenBank中参考序列进行同源性比对。结果判定PCR后阳性对照会出现一条362 bp