二胺氧化酶对川味香肠品质及生物胺含量的影响

1、PAGE PAGE - 12 -二胺氧化酶对川味香肠品质及生物胺含量的影响川味香肠是中国西南地区知名的传统发酵肉制品，因自然发酵风味浓郁、特点突出而深受消费者喜爱，消费市场和消费潜力巨大1。川味香肠高度依赖自然发酵，在生产过程中极易被微生物污染、易受季节及气候等因素影响，使得成品中的生物胺种类多、含量高。生物胺是由氨基酸脱羧酶将肉中游离氨基酸脱羧形成的一类含氮小分子化合物2。生物胺是人体生理代谢所需物质，但当机体内的生物胺积累到一定量时就会发生中毒反应，甚至危及生命3。目前，降低肉制品中生物胺含量的研究主要集中在将具有生物胺氧化酶活性的微生物作为发酵剂接种到肉制品中，生物胺氧化酶能将已存在的生

2、物胺分解为相应的醛、氨气和过氧化氢4。根据底物氨基个数通常可以将生物胺氧化酶分为单胺氧化酶、二胺氧化酶和多胺氧化酶。单胺氧化酶主要作用于酪胺、苯乙胺5；二胺氧化酶通常作用于组胺、尸胺和腐胺6；多胺氧化酶主要作用于精胺和亚精胺及腐胺7。翟钰佳8筛选到1株具有较强胺氧化酶活性的植物乳杆菌，将其作为发酵剂添加到羊肉发酵香肠中，发现香肠中生物胺含量显著降低。然而该种方法可能造成轻发酵食品发酵过度的情况9。黄瑶等10通过破碎黑曲霉细胞得到胺氧化酶的粗酶液，添加到自制酱油和市售酱油中，使市售酱油和自制酱油中总生物胺分别降低了69.5%和78.29%。NAILA等11在金枪鱼鱼汤中添加二胺氧化酶，发现组胺含

3、量显著降低，在10h时几乎降为0。利用生物胺氧化酶控制生物胺的技术目前主要应用于酱油和水产品中，在肉制品中的应用尚未见报道，并且在复杂的食品基质中添加生物胺氧化酶是否会对食品品质造成影响还有待探究。本研究基于生物胺氧化酶不具有底物特异性的特点12，将二胺氧化酶预添加到川味香肠中，探究该酶在川味香肠发酵、成熟过程中对感官品质以及对生物胺含量的影响，为实际生产中通过外源添加生物胺氧化酶的方式来控制发酵肉制品中生物胺的含量提供依据和理论参考。1材料与方法1.1材料与试剂新鲜猪肉、肠衣、食盐、花椒、白酒等调料，四川雅安市雨城区苍坪山农贸市场；二胺氧化酶(提取自猪肝脏)，美国SigmaAldrich公司

4、；MRS培养基等培养基，青岛日水生物技术有限公司；组胺、酪胺、腐胺、尸胺标准品、丹磺酰氯等，美国Sigma公司。1.2仪器与设备PHS-3CpH计，杭州奥立龙仪器有限公司；LC-2022CHT高效液相色谱仪，美国ThermoFisherScientific公司；BMS602均质机，德国BRT公司；(ANGGUANG)SC-8全自动色差计，北京康光仪器有限公司。1.3实验方法1.3.1川味香肠的制作与样品采集参照张雪梅13的配方，孙霞14的工艺流程、参数制作香肠。具体参数如下：(1)配方：猪肉m(肥肉)m(瘦肉)=37，食盐2.8%，白砂糖1%，白酒1.5%，辣椒粉1%，花椒粉0.5%，胡椒粉0

5、.05%，五香粉0.1%，硝酸盐0.015%，亚硝酸盐0.0075%(均为质量分数)，50mg/kg二胺氧化酶。(2)工艺流程：原料肉预处理添加配料加酶搅拌灌肠发酵成熟包装成品。(3)工艺参数：发酵温度20，相对湿度85%，时间2d；成熟温度13，成熟相对湿度75%，成熟时间28d。实验取样：取香肠加工过程中的7个工艺点，即0d(原料肉)、2d(发酵结束)、5d(成熟第3天)、9d(成熟第7天)、16d(成熟第14天)、23d(成熟第21天)、30d(成熟结束)进行采样。1.3.2感官品质1.3.2.1感官评价选择具有一定感官评定经验的10位品评员，从外观、组织形态、风味3个方面进行评价，具体

6、感官评价标准如表1所示。表1感官评价标准Table1Thetableforsensoryevaluationstandard1.3.2.2香气和滋味的电子鼻、电子舌检测电子鼻参照周兰15的方法；电子舌参照张楠16的方法。1.3.2.3颜色检测每组准备14个重复样品，将样品切割成1cm3，测定样品的L值，a*值、b*值。1.3.2.4质构检测参照张楠16的方法。1.3.3生物胺检测1.3.3.1取样参照张楠16的方法。1.3.3.2柱前衍生参考HUANG等17的方法，对样品中组胺、酪胺、尸胺、腐胺进行柱前衍生。1.3.3.3色谱条件参考HUANG等17的方法略作修改。色谱柱为C18(4.6mm2

7、50mm，5m)，流速为0.8mL/min，紫外检测器波长为254nm，进样量10L，柱温30，流动相A为超纯水，流动相B为色谱级乙腈，采用梯度洗脱程序进行分离：0min，35%A+65%B；5min，30%A+70%B；20min，0%A+100%B；25min35%A+65%B，持续至30min结束。1.3.4数据处理实验数据测量3次，所有数据均以平均值标准差表示，数据分析采用软件SPSS27.0，作图采用软件Origin2022进行。2结果与分析2.1感官品质测定结果2.1.1感官分析结果以外源添加50mg/kg二胺氧化酶的川味香肠为实验组，相同条件下未添加二胺氧化酶的为对照组，感官评价

8、结果如表2所示。2组香肠在外观、组织形态、风味及总分方面无显著差异。表明添加二胺氧化酶对川味香肠的感官品质并无影响，这可能是因为2组香肠采用了同样的原料及加工工艺。表2感官评分表单位：分Table2Resultsofsensoryevaluation注：相同小写字母表示差异不显著2.1.2香气和滋味的电子鼻及电子舌分析结果电子鼻的反应过程是模拟人体嗅觉形成的过程，而后通过主成分分析将信息进行降维处理。主成分分析贡献率越大，越能反应更多的指标18。从图1-a可以看出，第1主成分(PC1)与第2主成分(PC2)贡献率之和为99.9889%，大于90%，说明这2种主成分能较好的反应原始数据的全部信息

9、。2组香肠在主成分分析图上有部分重合，加酶组的覆盖面积相对较大，说明二胺氧化酶能够在一定程度上增加川味香肠的风味。但2组香肠在电子鼻雷达图中形成的图形形状差异不大(图1-c)，可能是因为使用相同的配方和加工工艺。与其他4根传感器相比，2组样品主要在P30/1及T30/1传感器上有较明显的响应，其中传感器P30/1响应最为显著，说明其中挥发性风味物质主要是有机化合物、极性化合物等19。电子舌是模拟人体味觉系统，并能识别出5种基本味道酸、甜、苦、咸、鲜，可以客观体现食品滋味20。由图1-b可以看出，PC1与PC2之和为99.7961%，2组川味香肠滋味较为类似，加酶组所占面积比对照组稍大，说明滋味

10、更加丰富。由电子舌雷达图1-d可以看出，2组川味香肠在各个传感器的响应值差距不大，反映出添加二胺氧化酶对香肠的滋味无显著性影响，呈味物质的组成和含量较为类似，这与感官结果相似。JE、JB、HA、CA、BB探头响应都较高，说明样品在酸味、鲜味、咸味方面较为突出，而在苦味上不显著21。a-电子鼻主成分分析图；b-电子舌主成分分析图；c-电子鼻雷达图；d-电子舌雷达图图1不同组川味香肠滋味及香气电子鼻及电子舌分析Fig.1AnalysisofthetasteandaromaofdifferentgroupsofSichuansausagesbyelectronicnoseandelectronict

11、ongue2.1.3质构检测结果质构会直接影响产品的感官，受水分含量、离子强度等多因素影响16。由表3可知，加酶组在硬度、弹性、黏结性、黏性、咀嚼性及回复性方面与对照组相比均没有显著性差异，这说明加酶不会对川味香肠质构产生显著影响。2.1.4色差测定结果2组香肠的色差检测结果如表4所示。与对照组相比，香肠成熟结束时加酶组的色差仅在a*值上有显著性差异。加酶组a*值随着发酵和成熟的进行，呈现先下降后上升，最后降低的趋势。可能是因为发酵过程中原料肉被空气中的氧气氧化，颜色变深，随后亚硝酸盐、硝酸盐被原料肉中微生物利用，进行了发色作用，颜色部分恢复，但随着产品中水分含量降低，色素浓缩，颜色再次加深，

12、a*值随之下降，与等22研究结果一致。随着香肠的成熟，加酶组的L值在发酵和成熟前期相较于原料肉无显著变化(P0.05)，仅在成熟末期有显著性上升(P0.05)，b*值变化趋势几乎一致且无显著性差异。表3两组川味香肠质构特性Table3TexturalcharacteristicsoftwogroupsofSichuansausage注：不同大写字母表示同行之间差异显著(下同)2.2川味香肠加工过程中生物胺含量的变化2.2.1川味香肠加工过程中总生物胺含量的变化情况川味香肠发酵、成熟过程中总生物胺含量变化情况如表5所示。随着香肠加工时间的推进，2组样品的总生物胺含量不断升高，表明加酶并不能完全抑

13、制生物胺的积累。与对照组相比，加酶组香肠中总胺含量增长较为缓慢，加酶组总生物胺含量显著低于对照组，表明添加二胺氧化酶能有效降低生物胺含量及其增长速率。表4川味香肠在加工过程中色差的变化Table4ColordifferenceofSichuan-stylesausagesduringfermentationandripening注：不同小写字母表示同列之间差异显著(下同)表5川味香肠发酵、成熟过程中总生物胺的变化Table5ChangesinthetotalamountofbiogenicaminesduringtheprocessingofSichuansausage2.2.2川味香肠加工过

14、程中组胺含量的变化情况组胺在常见生物胺中毒性最强，过量摄入组胺会引起机体过敏反应，甚至休克，美国食品及药物管理局(FoodandDrugAdministration，FDA)对水产品中组胺限定为50mg/kg。由图2可知，川味香肠中的组胺含量变化与总生物胺的趋势一致，对照组中组胺含量刚开始增加较为缓慢，从第9天开始快速增长，这可能是因为成熟温度、湿度适宜产组氨酸脱羧酶微生物的生长，利用原料肉中蛋白质降解产生的丰富游离组氨酸生成组胺。加酶组中的组胺含量在第30天时增加明显，达到61.79mg/kg，略高于FDA限量标准。与张楠16接菌生产的川味香肠成熟结束时组胺降解率(30.26%)相比，二胺氧

15、化酶(54.47%)控制组胺效果更显著。图2两组川味香肠发酵、成熟过程中组胺含量的变化Fig.2ChangesinhistaminecontentduringtheprocessingofSichuansausages2.2.3川味香肠加工过程中酪胺含量的变化情况酪胺属于单胺，和组胺一样是毒性最强的生物胺之一，口服超过100mg就会出现中毒现象23。由图3可以看出，2组川味香肠在加工过程中酪胺含量不断升高，但均未超过100mg/kg，对照组在成熟结束时达到83.4mg/kg。加酶组在整个加工过程中酪胺含量明显低于对照组，这说明二胺氧化酶能在一定程度上控制酪胺的含量。加酶组在第2天时酪胺含量增长

16、较为显著，可能是原料肉中含有丰富的游离酪氨酸、酪胺酸脱羧酶，在适宜条件下产生的；在成熟后期的第2330天，酪胺增长可能是因为蛋白质进一步降解氧化，产生大量酪氨酸所导致，这与孙霞14未加菌发酵川味香肠检测结果一致。对比组胺降解情况可以看出二胺氧化酶对于酪胺的控制效果不如组胺强，可能是酪胺是单胺，主要是由单胺氧化酶降解，而二胺氧化酶虽然也能降解，但效果不强。与孙霞等24混菌发酵生产的香肠(38.17%)相比，二胺氧化酶对酪胺的降解率(52.86%)更高。图3两组川味香肠发酵、成熟过程中酪胺含量的变化Fig.3Changesintyraminecontentduringtheprocessingof

17、Sichuansausages2.2.4川味香肠加工过程中腐胺含量的变化情况腐胺是一种二胺，过量的腐胺会产生不良气味，并抑制人体对组胺的分解，加强组胺的毒性25。由图4可以看出2组川味香肠在整个加工过程中腐胺含量呈上升趋势。从第5天开始明显增长，这可能是因为随着加工的进行，香肠的pH值逐渐降低，肉中产胺微生物为了抵御外界酸环境开始产生大量生物胺，同时pH值的降低也影响了二胺氧化酶的活性，因而对腐胺的降解速度不及其产生的速度，导致腐胺的积累；在成熟终点加酶组中腐胺含量低于对照组，降解率为6.29%，表明添加二胺氧化酶能降低川味香肠中腐胺含量。图4两组川味香肠发酵、成熟过程中腐胺含量的变化Fig.

18、4ChangesinputrescinecontentduringtheprocessingofSichuansausages2.2.5川味香肠加工过程中尸胺含量的变化情况尸胺也是一种二胺，虽然本身毒性不强，但其能与亚硝酸盐形成强致癌物N-亚硝胺，还能在一定程度上增强组胺毒性。由图5可以看出加酶组的尸胺含量随着加工的进行始终低于对照组，这说明二胺氧化酶对尸胺有较好的控制作用。在加工前5d，加酶组尸胺含量增加不显著，一方面可能是原料肉品质较好，尸胺的前体物质游离赖氨酸较少，所产生的尸胺也较少；另一方面，添加的二胺氧化酶能够分解一部分已生成的尸胺。从第9天起至成熟结束，加酶组尸胺含量出现了显著性的增长，达到46.07mg/kg。这可能与香肠成熟中后期环境变化所导致的二胺氧化酶活性降低有关。在成熟结束时，二胺氧化酶对尸胺降解率达到了43.69%，略低于组胺和酪胺。图5