免疫化学实验操作指导书：酶联免疫吸附实验

1、PAGE PAGE 271实验(八) 酶联免疫吸附实验酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA)是在免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原(抗体)吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体(抗原), 再加相应酶标记抗体(抗原),生成抗原(抗体)-待测抗体(抗原)-酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体(抗原)的量。待测抗体(抗原)的定量与有色产生成正比。一 酶的交联用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱

2、性磷酸酯酶，半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。辣根过氧化物酶交联在抗体上的方法主要有两种，即戊二醛法和过碘酸氧化法。 1戊二醛法戊二醛作为双活性试剂可将酶与抗体交联在一起，但戊二醛与蛋白质反应的机理各说不一，有的认为可能形成Michael加合物：也有人认为可能是产生不饱合醛，再与NH2反应成双Schiff碱蛋白衍生物：戊二醛交联法有一步法和二步法之分。一步交联法是把一定量的酶，抗

3、体和戊二醛同加入溶液中，在一定温度下反应一段时间，然后用透析法或凝胶过滤除去未结合的戊二醛即可得到酶结合物。在蛋白质与戊二醛的交联反应中，蛋白质赖氨酸基团是戊二醛最可能的反应部位，组成辣根过氧化物酶（HRP）的300多个氨基酸中只有6个赖氨酸。市售的HRP中，只有12个赖氨酸基团可供交联，而抗体分子中，赖氨酸基团含量要大得多，因此在一步交联中，HRP反应性不强，抗体分子在戊二醛作用下易形成聚合物，因此交联反应后必须用50饱和硫酸铵沉淀或用凝胶过滤除去聚合物。一步法酶结合物产率仅67，其中HRP约占5。在正常情况下，HRP只有一个戊二醛分子的一个醛基反应，而第二个醛基不能与同一个或其他酶反应，即

4、不发生聚合，故可将戊二醛先与HRP反应，透析除去未反应的戊二醛，再加入抗体，这样就不会产生聚合现象，此为二部交联法。产生的酶结合物中，其酶和抗体的mol比接近1：1，标记活性的损失比一步法少，但该法效率也不高，仅有25的HRP标记在抗体分子上，标记的抗体只占25，酶结合物的产率仅为1015。在实际运用中，酶与抗体mol比在12之间为宜，但未标记的抗体严重干扰检测结果，常用聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶(Ultrogel ACA-4A)过滤法除去未标记的抗体，无上述凝胶，也可Sephadex G-200代替。 2过碘酸盐氧化法辣根过氧化物酶是一种带糖的酶。糖含量约占18，过碘酸盐可将糖中的羟基氧化成醛基，

5、再与抗体直接连接。然后加硼氢化钠还原形成稳定的酶结合物。该法交联效果比戊二醛法好，结合物中HRP与抗体的mol比在23之间，参与酶结合物中的HRP可达70，而抗体则可达99。但在标记过程中，酶活性和抗体的免疫活性损失较多。 用戊二醛交联时，戊二醛的质量至关重要。戊二醛易挥发，久置可发生聚合和氧化，降低交联作用。由于戊二醛单体的光吸收峰是280nm，而聚合体则在235nm，故新鲜的，保存得法的戊二醛其A235/A280nm的比值小于3。戊二醛应避光.低温保存。 辣根过氧化物酶（HRP）是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素(protonhemin)区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯

6、化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是酶结合物的A(1cm 403nm)稀释倍数 HRP的A(1cm 403nm)酶结合物中HRP浓度(mg/ml) 酶结合物的A(1cm 403nm) 0.4稀释倍数（已知HRP的A(1cm 403nm 1%)25，式中1指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以 mg/ml 计算是HRP的A(1cm 403nm mg/ml=2.5)HRP纯度(RZ)=A403nm/A275nm纯度RZ（einheit Zahl）值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在3

7、.0左右，最高可达3.4。用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在3.0以上。二 酶与底物酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物。免疫技术常用的酶及其底物酶底 物显色反应测定波长/(nm)辣根过氧化物酶(HRP) 邻苯二胺(OPD)3.3.5.5四甲替联苯胺(TMB)5-氨基水杨酸(5-AS)邻联苯甲胺(OT)2,2-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐(ABTS)橘红色黄色棕色兰色蓝绿色492*, 460*450449425642碱性磷酸酯酶

8、4-硝基酚磷酸盐(PNP)萘酚-ASMx磷酸盐+重氮盐黄色红色400500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰黄色深蓝色405,420-半乳糖苷酶4-甲基伞酮基-半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光黄色360,450420 * 终止剂为2mol/L H2SO4 * 终止剂为2 mol/L柠檬酸， 不同的底物有不同的终止剂。可催化下列反应：HRP+H2O2复合物复合物+AH2过氧化物酶+H2O+AAH2 为无色底物, 供氢体； A 为有色产物。三 ELISA常用的四种方法直接法测定抗原将抗原吸附在载体表面；加酶标抗体，形成抗原抗体复合物；C. 加底物。底物的

9、降解量抗原量。 2间接法测定抗体将抗原吸附于固相载体表面；加抗体, 形成抗原-抗体复合物; 加酶标抗体；D. 加底物。 测定底物的降解量抗体量。 3双抗体夹心法测定抗原将抗原免疫第一种动物获得的抗体吸附于固相表面; 加抗原，形成抗原-抗体复合物; 加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗原抗体复合物; 加酶标抗抗体(第二种动物抗体的抗体); E. 加底物。底物的降解量抗原量。 4. 竞争法测定抗原将抗体吸附在固相载体表面; B.(1) 加入酶标抗原； B.(2),(3)加入酶标抗原和待测抗原； C. 加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差未知抗原量。四. 操作步骤1. 包被抗原：用包被液将抗原

10、作适当稀释, 一般为110微克/孔，每孔加200微升，37温育1小时后，4冰箱放置1618小时。 2. 洗涤：倒尽板孔中液体，加满洗涤液，静放三分钟，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。 3. 加封闭液200微升，37放置一小时。 4. 洗涤同2。 5. 加被检血清：用稀释液将被检血清作几种稀释,，每孔200微升。同时作稀释液对照。37放置2小时。 6. 洗涤同2。 7. 加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 放置37 1小时。 8. 洗涤同2。 9. 加底物：邻苯二胺溶液加200ml，室温暗处10-15分钟。 10. 加终止液：每孔50微升。 11. 观察结果：用酶联免疫检测仪记录490nm读数。五. 仪器和材料 1. 聚苯乙烯微量细胞培养板(平板, 40, 96孔)。 2. 酶联免疫检测仪 3. 辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 工作稀释度1:1000。4. 包被液:：0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液,4，保存,Na2CO3 0.15克, NaHCO3 0.293克,蒸馏水稀释至100 ml。5. 稀释液：0.01mol/LpH7.4 PBS-Tween-20, ，保存. NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4.12H2O 2.9g, Tween20，0.5ml. 蒸馏水加至1000ml。6. 洗涤液：同稀释液7. 封