卫生化学课件：高效液相色谱法

1、高效液相色谱法High Performance Liquid Chromatography 第一节 概 述第二节 流程及主要部件第三节 固定相和流动性第四节 影响色谱峰展宽的因素及分离条件的选择第五节 应用及进展高效液相色谱法High Performance Liquid Chromatography 3第一节 概 述特点高效液相色谱法 (high performance liquid chromatography, HPLC) 是60年代末在经典液相色谱法的基础上，应用在气相色谱实践中发展起来的色谱理论，建立并发展起来的一种新型分离分析技术。4在经典液相色谱中，由于使用粗颗粒的固定相，填充不

2、均匀，使分离的柱效低；依靠重力使流动相流动，使分析速度慢，且自动化程度低。560年代，Giddings等人将气相色谱中的塔板理论和速率理论应用于液相色谱领域。按照速率理论，要减少涡流扩散对柱效的影响，应使固定相的颗粒细，大小均匀，并且填充均匀。所以，通过改进固定相性质，并进而改变流动相的输送方式，就产生了HPLC。H = A + B/u + C u1. HPLC流程图一、高效液相色谱法的特点7与经典液相相比，HPLC具有以下特点：柱效高；分离速度快；分离效果好；检测灵敏度高；自动化程度高8 特点 柱效高HPLC首先使用了细颗粒(510m，而经典液相色谱法为150220m)、高效率的固定相和均匀

3、填充技术，从而使HPLC具备了新型高效的色谱分离柱，柱效可高达每米105理论塔板。H = A + B/u + C u9 分离速度快、分离效果好由于HPLC采用了细颗粒的固定相，使传统的依靠重力输液的方法彻底不可行，HPLC法中采用了高压泵输送流动相，使分离速度大大提高；通常的工作压力为几十 400大气压10 灵敏度高HPLC采用了高灵敏的检测器，将检测器接在柱后直接检测洗脱的各组分，根据组分的特性可采用紫外、荧光、电化学等不同检测器，最小检测量可达10-910-11g。11 自动化程度高HPLC仪器采用了先进的计算机技术，使HPLC整个系统的运行、操作都受计算机控制(色谱工作站)。2、HPLC

4、与GC相比较，具有以下优点：（）应用范围广（分析对象） ：GC：是在柱温下具有足够挥发度而且热稳定性好的物质，因此，GC限于气体分析和沸点较低物质的测定，而这些有机物仅占有机物总数的20。对于分子量较大(挥发性差)，或热分解型物质，一般就不能用GC法分离分析。HPLC：对于占有机物总数近80的高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，都可用HPLC进行分离分析。（）选择性好，分离能力强在分离能力方面，HPLC对于性质和结构相似的物质分离的可能性比GC更大，这是由于： （1） HPLC可利用被分离组分极性的差别，或大小的差别，或离子交换能力的差别，或生物分子间亲和力的差别进行分离。 （2） HPLC

5、可用多种溶剂作流动相，所以可通过改变流动相组成来改善分离效果(而GC的流动相为载气，不可随意改变其组成来改善分离)。对温度控制要求低 GC要求系统在稳定的高温下运行，而HPLC可以在室温下进行操作易于制备HPLC的馏分容易收集，所以HPLC除了用于分离分析外，还可用于分离制备。 HPLC与GC相比较，具有以下不足之处：缺乏通用型的高灵敏度检测器(目前常用的灵敏度较高的紫外、荧光检测器都是选择性检测器)；仪器比较复杂、昂贵；柱和流动相的消耗成本高；溶剂对环境和操作人员有影响。所以，对于既能用GC也能用HPLC测定的物质，一般还是用GC法更适当些。 应用HPLC在医药领域中主要用于药物的主成分含量

6、测定；杂质、分解产物和微量成分的测定。既用于对产品质量的检测，也用于药物研究开发，还用于药物代谢产物的分析、鉴定及临床治疗药物的监测。HPLC在临床医学研究中也有较大应用。例如对蛋白质、多肽、酶、激素等的分析和研究。HPLC在卫生、食品、环境等领域中应用也十分广泛，例如，各种维生素、食品添加剂等都可用HPLC检测，环境中的多环芳烃等可用HPLC检测。17药物研究领域药物质量控制：含量测定；杂质、分解产物和微量成分的测定。药物研究开发，药物代谢产物的分析、鉴定及临床治疗药物的监测。临床医学研究：对蛋白质、多肽、酶、激素等的分析和研究。卫生、食品、环境等领域食品添加剂检测无机阴阳离子、有机酸、氨基

7、酸、糖、维生素、脂肪酸、香料、甜味剂、防腐剂、人工色素、病原微生物、霉菌毒素、多核芳烃、食品安全、环境中污染物分析应用总结：HPLC是一种高效、快速的分离分析技术，具有灵敏度高、选择性好、自动化程度高的特点。HPLC的应用范围广，可分析的样品占有机物总数的约80，在生物化学、食品分析、临床检验、药物生产和研究、环境保护、化学化工等领域广泛应用。分类HPLC根据分离机理和采用固定相的不同，可分成不同类型，主要有如下常见的类型：1吸附色谱法2化学键合相色谱法(分配色谱法)3离子交换色谱、离子色谱、反相离子对色谱4排阻色谱(凝胶色谱法)20高效液相色谱仪21第二节 高效液相色谱仪 一般高效液相色谱仪

8、由五个部分组成：高压输液系统进样系统分离系统检测系统数据处理系统23高效液相色谱仪 HPLC仪器示意图其分离分析的流程为：流动相经过滤及脱气后，通过高压泵以恒定的流速流过柱子。当用进样器将样品注入到色谱柱顶端后，样品中各组分在流经柱子时被逐渐地分离，依次从柱后流出，进入检测器。检测器根据各组分浓度(含量)的大小，产生相应的信号，输至记录仪或数据处理装置，得到色谱图，并将色谱参数显示或记录下来，数据处理装置可将色谱参数换算成相应各组分的浓度。观看仪器流程动画27一、高压输液系统贮液装置高压输液泵过滤器脱气装置压力脉动阻滞器梯度洗脱装置一、高压输液系统(一)高压输液泵(high pressure pump)高效液相色谱的流动相是通过高压输液泵来输送的，泵的性能好坏直接影响整个高效液相色谱仪的质量和分析结果的可靠性。输液泵应具备如下性能：(1)流量稳定，流量的相对标准偏差应小于0.51%，这对定性定量准确性至关重要；(2)输出压力高，最高输出压力为50MPa(500kg/cm2)，一般可达150300kg/cm2；(3)流量范围宽，分析型应在0.110ml/min范围内连续可调，制备型应能达到100ml/min；输液泵应具备如下性能：