分子生物学精品课件

1、分子生物学第1页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一第六章 基因表达的调控（上）1原核生物基因表达调控原理 1.1 启动子与转录起始 1.1.1 启动子的基本结构1.1.2 启动子对转录起始的调节1.1.3 增强子对转录起始的调节1.1.4 因子对转录起始的调控1.1.5 环状腺苷酸受体蛋白对转录的调控第2页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一1.2 操纵子调控模型1.2.1 操纵子基因表达调控的基本原理1.2.1.1 操纵子学说1.2.1.2 正调控与负调控1.2.2 乳糖操纵子1.2.2.1 lac基因的诱导表达1.2.2.2 lac操纵子模型1.2

2、.2.3 lac操纵子的正调控第3页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一1.2.3 半乳糖操纵子1.2.3.1 cAMP-CAP对gal启动子的作用1.2.3.2 双启动子的生理功能1.2.3.3 gal阻遏蛋白的作用1.2.4 阿拉伯糖操纵子1.2.5 色氨酸操纵子1.2.5.1 trp操纵子的阻遏系统1.2.5.2 弱化子的调控系统第4页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一1.2.6 噬菌体操纵子 1.2.6.1 噬菌体的溶原和溶菌途径1.2.6.2 噬菌体的基因组及调控蛋白1.2.6.3 溶菌途径的建立1.2.6.4 溶原途径的建立1.3 翻译水平

3、的调控 1.3.1 稀有密码子对翻译的影响 1.3.2 重叠基因对翻译的影响第5页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一1.3.3 终止子对翻译的影响1.3.4 翻译的阻遏1.3.5 RNA高级结构对翻译的影响1.3.6 反义RNA对翻译的影响1.3.7 魔斑核苷酸水平对翻译的影响第6页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一第六章 基因表达的调控 我们知道，所有生物的遗传信息都是以基因的形式储藏在DNA（或RNA）分子中的。随着个体的发育，DNA分子能有序地将其所承载的遗传信息通过密码子与反密码子系统转变成蛋白质分子，执行各种生理生化功能，完成生命的全过程。

4、第7页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一我们把从DNA到蛋白质的过程称为基因表达，对这个过程的调节就称为基因表达调控。基因表达的调控是现阶段分子生物学研究的中心课题。要了解动、植物生长发育的规律、形态结构特征和生物学功能，就必须弄清楚基因表达调控的时间和空间概念，掌握基因表达调控的秘密。 第8页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一原核生物和单细胞真核生物直接暴露在变幻莫测的环境中，食物供应毫无保障，只有根据环境条件的改变合成不同的蛋白质，使代谢过程适应环境的变化，才能维持自身的生存和繁衍。高等真核生物代谢途经和食物来源比较稳定，但由于它们是多细胞有机体

5、，在个体发育过程中出现细胞分化，形成各种组织和器官，而不同的细胞所合成的蛋白质在质和量上是不同的，而且在不同的发育过程中表达不同的基因，合成不同的蛋白质。第9页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一因此，不论是原核生物还是真核生物都有一套准确的调节基因表达和蛋白质合成的机制。基因表达的调控主要表现为：转录水平上的调控；mRNA加工成熟水平上的调控；翻译水平上的调控等等。第10页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一基因调控的指挥系统也是多样的，不同的生物使用不同的信号来指挥基因调控。原核生物中，营养状况和环境因素对基因表达的调控有着举足轻重的影响。真核生物尤

6、其是高等真核生物中，激素水平和发育阶段是基因表达调控的最主要手段，营养和环境因素的影响力大为下降。第11页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一到目前为止，原核生物基因表达调控的研究已经相当彻底，许多问题已经解决，而对真核生物基因表达调控的研究还刚刚开始，不少情况下人们只能以原核生物中学到的知识来推测真核生物的机理。其次，为了更好地了解真核生物基因调控机理的复杂性，也很有必要看看原核生物的情况。所以在这一章中我们先介绍原核生物基因表达的调控。 第12页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一1原核生物基因表达调控原理 原核生物细胞的基因和蛋白质种类较少，如大肠

7、杆菌基因组约为4106bp，假如平均每个基因长1000bp，一个细胞就有4000个左右的基因，能合成4000种左右的蛋白质。据估计，一个细胞中总共含有107个蛋白质分子，如果每个基因都等同翻译的话，任何一个多肽应有2500个拷贝，但是这些蛋白质并不是以相同拷贝数存在于细胞中的。第13页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一有些蛋白质的数目相当固定。例如，每个大肠杆菌细胞可以有约15000个核糖体，与其结合的约50种核糖体蛋白质数量是十分稳定的。糖分解体系的酶含量很大，其数目也极恒定。此外，DNA聚合酶、RNA聚合酶等都有是代谢过程中十分必需的酶或蛋白质，其合成速率不受环境变化

8、或代谢状态的影响。在正常情况下经常合成的蛋白质称为永久型蛋白质。第14页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一另一类蛋白质的合成速率明显受环境的影响。例如，一般情况下，一个大肠杆菌中只有15个分子的-半乳糖苷酶，但若将细胞培养在只含乳糖的培养基中，每个细胞中这种酶的数量可高达几万个分子。其他糖代谢的酶、氨基酸、核苷酸合成系统的酶类，其合成速度和总量也都随培养条件的变化而改变。合成速率明显受环境的影响蛋白质称为适应型或调节型蛋白质。第15页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一细菌所利用的调节机制主要是转录水平的调控，即一个体系的基因在需要时被打开，大量合成m

9、RNA，从而合成大量的蛋白质；不需要时被关闭。所谓关闭并不是说干脆不合成mRNA，而是只合成极少量的mRNA，常常是每个世代每个细胞只合成12个mRNA分子，因而可合成少量的蛋白质。第16页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一 1.1 启动子与转录起始 转录是基因表达的关键性步骤。在RNA聚合酶作用下，转录从一个特异的起点开始，按照碱基配对原则准确地转录DNA序列，到特异的终止部位结束，合成出一条RNA链。为RNA聚合酶提供识别、结合和开始转录信号的一段DNA序列称为启动子（promoter）。提供转录终止信号的一段DNA序列称为终止子（terminator）。从启动子开始

10、到终止子结束的DNA序列称为转录单元。在细菌中，一个转录单元可以是一个基因，也可以是几个基因。第17页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一转录是由RNA聚合酶催化完成的。原核生物的RNA聚合酶全酶由五个亚基组成，可表示为“2”。没有因子的酶叫做核心酶，可表示为“2”。因子（亚基）的功能在于识别启动子，并使RNA聚合酶全酶能稳定地结合到DNA的启动子上。单独的核心酶也能与DNA结合，但不能找到模板DNA上的起始位点，因为没有固定的起始位点，而且两条链都可以作为模板，所以合成的产物是不均一的。第18页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一因子能够改变RNA聚合

11、酶与DNA之间的亲合力，它极大地减少了酶与一般序列的结合常数和停留时间，同时又极大地增加了酶与DNA启动子的结合常数和停留时间。这样就使得全酶能迅速地找到启动子并与之相结合。所以，只有带有因子的全酶才能专一地与DNA上的启动子结合，选择其中一条链作模板，合成均一的产物。因子的作用也只是起始而已，一旦转录开始，它就离开了起始复合物，而由核心酶负责RNA链的延伸。因此，全酶的作用是选择和起始，核心酶的作用是链的延长。第19页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一转录的起始是基因表达的关键阶段，这一阶段的重要问题是RNA聚合酶与启动子的相互作用。启动子的结构影响了它与RNA聚合酶的

12、亲合力，从而影响基因的表达水平。许多调控因素也正是通过改变启动子与RNA聚合酶的亲合力来调控基因表达的 。第20页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一 1.1.1 启动子的基本结构 启动子是RNA聚合酶的识别和结合区，其结构直接关系到转录的效率。Pribnow设计的实验证明了启动子的结构特征：让RNA聚合酶全酶与DNA结合后，用DNase水解DNA，然后用苯酚抽提，沉淀纯化后得到一段被RNA聚合酶保护下来的DNA片段，再对此片段进行序列分析和比较。Pribnow以及其他一些科学家经过多年的努力，分析比较了几十种大杆肠启动子和多种噬菌体的启动子序列，证实原核生物的所有启动子都

13、有两段共同序列，即-10序列和-35序列。第21页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一通常将转录起点的第一个核苷酸以+1来表示，从近到远以正数计，称为下游；起点前一个核苷酸以-1来表示，从近到远以负数计，称为上游。大肠杆菌的-10处有一个6bp的保守序列TATAAT， 称为Pribnow框或-10序列，-35处又有一个6bp的保守序列TTGACA，称为识别区域或-35序列。第22页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一实验证明，-35序列的突变将降低RNA聚合酶与启动子结合的速度，但不影响转录起点附近DNA的解链速度；而-10序列的突变不影响RNA聚合酶与

14、启动子结合的速度，可是会降低DNA的解链速度。因此认为：-35序列是RNA聚合酶的结合部位，RNA聚合酶与启动子结合的强弱程度就取决于该序列的变化。而-10序列是DNA的解链部位，-10序列含有较多的A、T碱基对，因而从此位置解链所需要的能量比较低。 第23页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一 1.1.2 启动子对转录起始的调节 启动子的核苷酸序列影响着RNA聚合酶与启动子的亲合力，从而直接影响着转录的起始频率。例如，在大肠杆菌中，有些基因每秒钟可转录1次，而另一些基因每代才转录1次。这种转录起始频率的不同，归因于启动子序列的差异，在没有调节蛋白的情况下，不同核苷酸序列的

15、启动子启动转录的频率相差1 000倍以上。第24页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一这样就存在着强弱启动子之分，在基因工程操作中，为了提高外源基因在宿主细胞中的表达水平，一般采用强启动子，如一些原核表达载体中的T7启动子、Lac启动子等都是较强的启动子。此外，启动子的核苷酸序列还影响转录起始的准确性。启动子突变不仅影响转录效率，某些突变还可能使正确转录本的得率大大降低。第25页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一在细菌中常见两种启动子突变。一种叫下降突变，可降低转录水平，甚至丧失转录功能。例如把-10序列从TATAAT变成AATAAT就会大大降低其结构

16、基因的转录水平。另一种叫上升突变，这种突变是增加-10序列的同源性。例如，在乳糖操纵子中，将其-10序列从TATGTT变成TATAAT，就会提高启动子的效率，提高乳糖操纵子的转录水平。第26页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一启动子保守序列之间的距离也影响着转录的起始频率。原核生物强启动子的-10和-35区域之间的间隔为171bp，增大或减小明显影响启动子的强度。这可以解释为-35区相对-10区旋转所产生的超螺旋发生了改变，增减一个bp会使两者之间的夹角发生36的改变。在这情况下，要使酶与DNA在这个区域内具有正确的取向，则必须使二者之一发生扭曲，这就需要增加结合自由能。

17、所以，保持启动子这两个区段序列和它们之间的距离是十分重要的，否则就会改变它所控制基因的表达。 第27页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一 1.1.3 增强子对转录起始的调节 近年来还发现了与转录起始有关的另一序列。这个序列是1980年首先在SV40的转录单元上发现的，位于转录起始点上游约200bp处有两段72 bp长的重复序列，它能增强转录的起始，除去这两段序列会大大降低细胞内的转录水平，但若保留其中之一或将其取出插至DNA分子的任何部位，转录都能保持正常。将这种能强化转录起始的序列称为增强子或强化子。第28页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一除SV

18、40外，还在反转录病毒基因和真核生物的免疫球蛋白基因、胰岛素基因、胰糜乳蛋白酶基因等许多基因中陆续发现了增强子的存在。有实验证明，若把-珠蛋白基因置于带72bp序列的DNA分子上，发现它在体内的转录水平可提高200倍，这段72 bp序列被放在转录起始点上游1 400 bp或下游3 300 bp处，仍具有增强作用。所以，增强子的作用可能不受位置的影响。当然，也不是所有的启动子都对增强子敏感，-珠蛋白基因的启动子不受SV40的72 bp序列的影响。第29页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一增强子的作用机制还不清楚，它可能是通过影响染色体DNA蛋白质结构或改变超螺旋的密度而改变

19、模板的整体结构，来达到增强转录目的的。 第30页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一 1.1.4 因子对转录起始的调控 因子是细菌RNA聚合酶的一个亚基（全酶形式为：“2”），它在RNA聚合酶与启动子的特异性结合过程中起了极其重要的作用。因子能极大地增加RNA聚合酶与启动子序列的结合常数和停留时间，能极大地降低酶与DNA非特异性序列的结合常数和停留时间。由于电荷作用，核心酶（可表示为：“2”）本身也与DNA也有亲合力，但这种亲合力缺乏序列特性。第31页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一因子的存在则极大地提高了酶对启动子区的特异性结合力，同时又降低了与非

20、特异性DNA结合力。实验证明，具有因子的全酶与非特异性DNA的结合常数是核心酶的万分之一，全酶与非特异性DNA复合物的半衰期小于1s，而核心酶与非特异性DNA复合物的半衰期为1h。实验还发现，全酶与特异性序列结合的平均能力比核心酶高1000倍，全酶与启动子复合物的半衰期为几小时。在某些细菌的细胞内含有不同的因子，它们能识别不同的启动子，因而具有调控不同基因转录的作用，以适应生长发育不同阶段和不同环境条件的要求。第32页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一例如，在大肠杆菌中，由rpoD基因编码的70（右上角数字代表相对分子质量，103）是细胞生命活动过程中最常见的调控因子，由

21、rpoH基因编码的32是与热休克基因转录表达有关的特异性因子，而rpoN基因编码的54则参与细胞的氮代谢（表5-1）。在热休克情况下，70被32所取代，RNA聚合酶则不能结合在标准的启动子上，却特异的结合在另一类控制热休克反应基因的启动子上，启动热休克反应。 第33页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一 1.1.5 环状腺苷酸受体蛋白对转录的调控 环状腺苷酸（cAMP）受体蛋白（CRP）又称为降解物基因活化蛋白（分解代谢物激活蛋白，CAP）。CRP是一种正调节因子，当它与启动子结合后，可促进基因的转录。但它与启动子结合时必须要有配体分子cAMP的存在。例如，大肠杆菌生长在缺

22、乏葡萄糖的培养基中时，cAMP合成量增加（葡萄糖酵解的某些中间产物可能抑制细菌的腺苷酸环化酶活性），cAMP与CRP结合形成的cAMP-CRP复合物具有激活乳糖（lac）、半乳糖（gal）和麦芽糖（mal）等启动子的功能。第34页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一CRP是由两个相同的亚基组成的二聚体，每个亚基含有210个氨基酸残基，分为两个结构域。氨基末端结构域与cAMP结合，羧基末端结构域与DNA结合。cAMP的结合能提高CRP对DNA的亲合力，而CRP与启动子的结合是激活转录的必要条件。研究表明，一些依赖于CRP的启动子缺乏一般启动子所具有的典型的-35区序列特征，因

23、此，大肠杆菌RNA聚合酶难以与其结合，而CRP的存在能显著提高酶与启动子的结合常数。当CRP与乳糖启动子结合后，使DNA做90180的弯曲，为酶分子提供了结合部位。第35页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一另一方面，酶的存在又能提高cAMP-CRP与乳糖和半乳糖启动子的亲合力，在cAMP存在的情况下，酶能与CRP共沉淀，这些事实说明，酶与CRP可以发生相互作用。由此推想，CRP通过改变启动子构象以及与酶的相互作用帮助酶分子正确定向以便与-10区结合，起到了替代-35区功能的作用。此外，CRP还能抑制RNA聚合酶与DNA中其他位点的结合，从而提高与某一特定启动子结合的概率。

24、 第36页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一 1.2.1 操纵子基因表达调控的基本原理1.2.1.1 操纵子学说操纵子学说是关于原核生物基因结构及其表达调控的学说，它是由法国巴斯德研究所的著名科学家Jacob和Monod在1961年得出的，并在10年内经过许多科学家的补充和修正才得以逐步完善。 第37页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一此学说认为，在细菌中，为一个代谢途经所需要的几种酶的结构基因，可沿DNA直线排列在一起，并受一个共同的启动基因和操纵基因的控制，把这样的启动基因、操纵基因和结构基因可以看做一个单位，称为操纵子。在转录时，RNA聚合酶必

25、须结合在启动基因上，通过操纵基因才能转录结构基因，从而合成多顺反子mRNA。转录调控就是在启动基因和操纵基因上进行的。 启动基因（P）操纵基因（O）结构基因35RNA聚合酶第38页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一 1.2.1.2 正调控与负调控 操纵基因是调节基因的产物（调节蛋白）的结合位点。调节基因的产物有两类：阻遏蛋白（阻遏物）和激活蛋白（激活物）。阻遏蛋白与DNA结合后，使转录处在关闭状态，称为负调控。阻遏蛋白分为有活性型和无活性型两种形式，前者可与DNA分子结合，后者则不能与DNA分子结合。第39页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一调节物分

26、子（信号分子，可分为诱导物和抑制物两类）可改变阻遏蛋白的构象和性质：抑制物（辅阻遏物，如途径产物）与无活性的阻遏蛋白结合后，可使其转变为有活性形式，从而关闭基因的转录；诱导物（如途径的底物）与有活性的阻遏蛋白结合后，可使其转变为无活性形式，从而开启基因的转录。第40页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一激活蛋白与DNA结合后，使转录处在开启状态，称为正调控。激活蛋白也分为有活性型和无活性型两种形式。前者可与DNA分子结合，后者则不能与DNA分子结合。激活蛋白的构象和性质也受调节物分子的影响：诱导物与无活性的激活蛋白结合后，可使其转变为有活性形式，从而开启基因的转录；抑制物与

27、有活性的激活蛋白结合后，可使其转变为无活性形式，从而关闭基因的转录。第41页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一在降解代谢途经中，途经的底物（如乳糖操纵子中的乳糖）往往是代谢的调节物，它决定着是否合成途经中的各种酶。相反，在合成代谢中，最终产物（如色氨酸操纵子中的色氨酸）则往往是调节物。 第42页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一 1.2.2 乳糖操纵子（lactose operon）大肠杆菌乳糖操纵子包括3个结构基因：Z、Y和A，以及启动子、操纵基因和调节基因（阻遏子）等。乙酰转移酶透过酶-半乳糖苷酶阻遏蛋白功能二聚体6.0104膜蛋白3.0104四

28、聚体5.0105三聚体1.14105蛋白质3.0 1043.0 1041.25 1053.8104多肽lacA825lacY780lacZ3510P O82lacI1040DNAmRNA第43页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一3个结构基因各决定一种酶：Z编码-半乳糖苷酶；Y编码-半乳糖苷透过酶；A编码-半乳糖苷乙酰转移酶。转录时，RNA聚合酶首先与启动区（P）结合，通过操纵区（O）向右转录。转录从O区的中间开始，按ZYA的方向进行，每次转录出的一条mRNA上都带有这3个基因。转录的调控是在启动区和操纵区进行的。第44页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星

29、期一-半乳糖苷酶是一种-半乳糖苷健的专一性水解酶，除能水解乳糖成为葡萄糖和半乳糖外，还能催化乳糖异构化成为异构乳糖。-半乳糖苷透过酶的作用是使外界的-半乳糖苷（如乳糖）能透过大肠杆菌细胞壁和原生质膜进入细胞内。所以大肠杆菌如果以乳糖为碳源或能源的话，以上两种酶是必需的。-半乳糖苷乙酰转移酶的作用是把乙酰CoA上的乙酰基转移到-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖，它在乳糖的利用中并非是必需的。第45页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一 1.2.2.1 lac基因的诱导表达 乳糖代谢体系的开启和关闭过程如下： 在不含乳糖及-半乳糖苷的培养基中，lac+基因型大肠杆菌细胞内-半乳糖苷酶

30、和透过酶的浓度很低，每个细胞内大约只有12个酶分子。但是，如果在培养基中加入乳糖（但无葡萄糖存在），酶浓度很快就达到了细胞总蛋白量的6%或7%，每个细胞中可有超过105个酶分子。第46页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一 在有乳糖而无葡萄糖的培养基上，lac+细菌的-半乳糖苷酶和透过酶将同时合成。进一步用32P标记的mRNA与模板DNA进行定量分子杂交，表明培养基中加入乳糖12min后，编码-半乳糖苷酶和透过酶的lac mRNA量就明显迅速增加。去掉乳糖后，lac mRNA量立即下降到几乎无法检测的程度，表明乳糖确实能激发lac mRNA的合成。第47页，共158页，20

31、22年，5月20日，9点57分，星期一第48页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一 如果将葡萄糖和乳糖同时加入到培养基中，大肠杆菌在耗尽外源葡萄糖之前不会诱发lac操纵子，这是因为，葡萄糖的某些降解产物抑制了lac mRNA的合成，没有lac mRNA的合成，也就没有-半乳糖苷酶产生，把葡萄糖的这种效应称之为代谢阻遏物效应。 第49页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一 1.2.2.2 lac操纵子模型 lac操纵子已被人们广泛接受，其主要内容如下：Z、Y、A基因的产物由同一条多顺反子mRNA分子所编码。 这个mRNA分子的启动子（P）紧接着操纵基因（O

32、）区，而位于调节基因（I）与O区之间。该启动子不能单独起动合成-半乳糖苷酶和透过酶的生理过程。 第50页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一操纵基因是DNA上的一小段序列（仅为26bp），是阻遏物（阻遏蛋白）的结合位点。当阻遏物与操纵基因结合时，lac mRNA转录的起始过程受到抑制。 诱导物通过与阻遏物结合，改变它的三维构象，使之不能与操纵基因结合，从而激发lac mRNA的合成。这就是说，有诱导物存在时，操纵基因没有被阻遏物占据，所以启动子能够顺利起始mRNA的合成。第51页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一这一简单模型解释了lac体系及其它负调控

33、系统的许多现象，但这种解释也不是十分完善的,因为乳糖操纵子中同样也存在着正调控。. lac操纵子的本底水平表达首先，诱导物需要穿过细胞膜才能与阻遏物结合，而转运诱导物需要透过酶，后者的合成又需要诱导。这就需要有一些透过酶可以在没有诱导物的情况下合成。第52页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一其次，在研究中还发现，乳糖（葡萄糖-1,4-半乳糖）并不和阻遏物结合，真正与阻遏物相结合的诱导物是乳糖的异构体异构乳糖（葡萄糖-1,6-半乳糖）。但是，异构乳糖是-半乳糖苷酶催化乳糖形成的，这就需要-半乳糖苷酶预先存在。目前，对这两个问题的解释是：在非诱导状态下就有少量lac mRNA

34、合成（大约每代有15个mRNA分子），这种合成称为本底水平的永久型合成。第53页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一由于阻遏物的结合并不是绝对紧密的，即使在它与操纵基因紧密结合时，也会偶而掉下来；这时启动子的障碍被解除，mRNA聚合酶开始转录。这种现象以每个细胞周期1次的概率发生。 第54页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一. lac+大肠杆菌对乳糖的反应按照lac操纵子本底水平的表达，在无诱导物的情况下，每个大肠杆菌细胞内可有几个分子的-半乳糖苷酶和透过酶。现在，如果将其放在以乳糖为唯一碳源的培养基上培养，则在单个透过酶的作用下，少量乳糖进入细胞，又

35、在单个-半乳糖苷酶分子的作用下转变成异构乳糖。某个异构乳糖与操纵基因上的阻遏物结合，并使后者失活而离开基因，这样mRNA的合成就开始了。第55页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一这些mRNA分子编码大量的-半乳糖苷酶及透过酶，其结果使乳糖涌入细胞。多数乳糖被降解成为葡萄糖和半乳糖；但还有许多乳糖被转变成异构乳糖，然后与细胞内的阻遏物结合（虽然合成速度低，但阻遏物仍继续合成，因此通常有足够的异构乳糖使细胞维持着去阻遏状态），阻遏物的失活促使mRNA的高速合成，进一步提高了透过酶和-半乳糖苷酶的浓度。降解产生的葡萄糖被用作碳源和能源；降解产生的半乳糖则被另一套酶体系转变成葡萄

36、糖，这些酶的合成也是可诱导的。这个可诱导体系就是半乳糖操纵子，半乳糖是它的诱导物。第56页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一当培养基和细胞中的所有乳糖都被消耗完的时候，由于阻遏物还在不断地合成着，有活性的阻遏物浓度将超过异构乳糖的浓度，细胞重新建立起阻遏状态，lac mRNA合成被抑制。在细菌中，多数mRNA的半衰期只有几分钟，所以在不到一个世代的生长期内，lac mRNA几乎从细胞内消失。-半乳糖苷酶及透过酶的合成也趋向停止，这些蛋白质虽然很稳定，但其浓度随着细胞分裂而不断被稀释。如果在乳糖被撤去的一个世代中重新加入乳糖，这时乳糖可以立即被降解，因为此时细胞内仍有一定浓

37、度的透过酶和-半乳糖苷酶。 第57页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一 1.2.2.3 lac操纵子的正调控 如果将葡萄糖和乳糖同时加入到培养基中，大肠杆菌在耗尽外源葡萄糖之前不会诱发lac操纵子，这是因为，葡萄糖的某些降解产物抑制了lac mRNA的合成，没有lac mRNA的合成，也就没有-半乳糖苷酶产生，把葡萄糖的这种效应称之为代谢阻遏物效应（catabolite repression）。这是因为lac mRNA转录的起动还依赖于cAMP及其受体蛋白分解代谢物激活蛋白（CAP或CRP）。第58页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一广泛存在于动植物

38、组织中的cAMP（在腺苷酸化酶的作用下由ATP转变而来的，在许多真核生物激素调节过程中起着重要作用）也存在于大肠杆菌细胞中，其浓度受葡萄糖代谢的调节。如果将细菌放在缺乏碳源的培养基中培养。细胞内cAMP浓度非常高；如果在含葡萄糖的培养基中培养，cAMP的浓度就很低；如果培养基中只有甘油或乳糖等不进行糖酵解途经的碳源，cAMP的浓度也会很高，因此推测糖酵解途经中位于葡萄糖-6-磷酸与甘油之间的某些代谢产物是腺苷酸环化酶的抑制剂。第59页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一大肠杆菌中的分解代谢物激活蛋白由Crp基因编码，能与cAMP形成复合物。凡Crp基因及腺苷酸环化酶基因突变

39、的细菌都不能合成lac mRNA。所以CAP和cAMP都是合成lac mRNA所必需的。事实上，cAMP-CAP复合物是lac体系中一个有活性的复合物，细菌对于此复合物的需要是独立的，与阻遏体系无关。lac mRNA的转录必须要有cAMP-CAP复合物结合在DNA的启动子区域上。所以，人们认为cAMP-CAP是一个不同于阻遏物的正调控因子，而lac操纵子的功能是在正、负这两个相互独立的调控体系作用下实现的。第60页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一此外，半乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖、山梨醇等，在降解过程中均能被转化成葡萄糖或糖酵解途经中的其他中间产物，所以这些糖代谢中有关的酶

40、都是由可诱导的操纵子控制的。只要有葡萄糖存在，这些操纵子就不表达，被称为降解物敏感型操纵子（catabolite sensitive operon），这些操纵子都是由cAMP-CAP调节的。对一些降解敏感型操纵子进行生化分析表明，这些体系中每个操纵子都有cAMP-CAP结合位点，此结合位点非常接近RNA聚合酶的作用位点，但不与之重合。 第61页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一 1.2.3 半乳糖操纵子 大肠杆菌半乳糖操纵子（galactose operon）包括3个结构基因：半乳糖差向异构酶（galE）、半乳糖-磷酸尿嘧啶核苷转移酶（galT）和半乳糖激酶（galK）。

41、三种酶催化的反应如下： 半乳糖+ATP半乳糖-1-磷酸+ADP半乳糖激酶半乳糖-1-磷酸+UTPUDP-半乳糖+PPi转移酶UDP-半乳糖异构酶UDP-葡萄糖第62页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一半乳糖操纵子的特点如下： 结构基因按E、T、K的顺序排列。与galE基因相邻的是启动子（P）区。gal操纵子有两个启动子，其mRNA可从两个不同的起始点开始转录。galE操纵子有两个O区，一个在P区的上游-67-53处，另一个在galE结构基因内部。gal操纵子的调节基因galR距离结构基因及O区很远，其产物对galO的作用与lacI的产物对lacO的作用相同。gal操纵子的

42、诱导物是半乳糖。 第63页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一 1.2.3.1 cAMP-CAP对gal启动子的作用 细菌对半乳糖利用效率要比葡萄糖低得多，人们可能会猜想，当葡萄糖存在时半乳糖操纵子不会被诱导。但实际上在葡萄糖存在时，gal操纵子仍然可被诱导。现在人们已分离到了一些突变株，其中一类突变株在不含葡萄糖的培养基上能高效表达gal结构基因；而另一类突变株在不含葡萄糖的培养基上，不表达gal结构基因。第64页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一据此认为gal操纵子有两个启动子。通过对P-O区的碱基序列分析，证实确实有两个相互重叠的启动子。galP

43、1是依赖于cAMP-CAP的启动子，转录起始点为S1；galP2是不依赖于cAMP-CAP的启动子，转录起始点为S2。两个启动子各有自己的Pribnow框，但相距仅为5bp。 第65页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一体外实验证明，cAMP-CAP能促进从S1起始的转录，抑制从S2起始的转录。在无葡萄糖的培养基中，细胞内具有较高浓度的cAMP-CAP，RNA聚合酶与galP1结合，从S1起始转录。在有葡萄糖的培养基中，细胞内的cAMP-CAP浓度低，RNA聚合酶与galP2结合，从S2起始转录。那么，cAMP-CAP是如何控制galP1和galP2的呢？第66页，共158

44、页，2022年，5月20日，9点57分，星期一通过足迹法和DNA测序法已证实，cAMP-CAP在gal操纵子上的结合位点在-76-47处，与在lac操纵子上的结合位点（-72-52处）大致相同，结合位点的序列也相近。然而这并不是说在每个操纵子都是这种情况，实际上cAMP-CAP在各个操纵子上的结合位点的位置和序列差异很大。第67页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一据推测，cAMP-CAP与其在gal操纵子上的结合位点结合后，有利于RNA聚合酶与的galP1结合，从而促进了从S1起始的转录。但由于该位点距离galP2近，所以cAMP-CAP的结合妨碍了RNA聚合酶与的gal

45、P2结合，抑制了从S2起始转录。 第68页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一 1.2.3.2 双启动子的生理功能 为什么gal操纵子需要两个启动子呢？据分析这与半乳糖在代谢中的双重作用有关。一方面半乳糖可作为唯一的碳源供细胞生长；另一方面UDP-半乳糖是合成大肠杆菌细胞壁的前体。在无外源半乳糖的情况下，大肠杆菌必须通过半乳糖差向异构酶将UDP-葡萄糖转化为UDP-半乳糖，而该酶正是galE的产物，但细胞壁合成过程中对该酶的需求量并不大，这就需要一个gal操纵子本底水平的永久型表达。这种本底水平的表达是由galP2启动的，它不因葡萄糖的存在而被抑制。第69页，共158页，2

46、022年，5月20日，9点57分，星期一我们可以设想，如果只有galP1存在，由于它依赖于cAMP-CAP，当培养基中有葡萄糖时就不能合成差向异构酶。假若只有galP2存在，由于它不依赖于cAMP-CAP，那么即使培养基中有葡萄糖，半乳糖操纵子也将处在表达状态，这无疑是一种浪费。所以，从必要性和经济性两方面考虑，确需要一个不依赖于cAMP-CAP的启动子（galP2）进行本底水平的永久型表达，以及一个依赖于cAMP-CAP的启动子（galP1）对高水平表达进行控制。因此，有了双启动子，既能满足平时的本底水平表达的需要，又能满足缺乏葡萄糖时的高水平表达的需要。 第70页，共158页，2022年，

47、5月20日，9点57分，星期一 1.2.3.3 gal阻遏蛋白的作用 迄今为至，关于gal阻遏蛋白的作用机理还不太清楚。所有已知的galO突变均发生在cAMP-CAP结合位点（-60左右），离两个Prebnow框如此之远，是不可能采取lac阻遏蛋白那种作用机制的。很有可能是因为gal阻遏蛋白与galO的结合妨碍了cAMP-CAP与其位点的结合或改变了cAMP-CAP对转录的促进作用。第71页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一最近有人发现了在galE的编码区内存在的另一个galO位点（+46+60），称之为galOI，而将-60左右处的galO称为galOE，两者的序列有一

48、定同源性。galOI的作用机制也不清楚，但galOI的存在能够加强galOE对转录的阻遏作用。 第72页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一 1.2.4 阿拉伯糖操纵子 阿拉伯糖（arabinose）是作为碳源的五碳糖。在大肠杆菌中阿拉伯糖的降解需要三种酶的作用，它们是核酮糖激酶、L-阿拉伯糖异构酶和L-核酮糖-5-磷酸差向异构酶，分别由结构基因araB、araA和araD编码（简写为araBAD），这三个基因形成一个基因簇。三种酶催化的反应如下： 阿拉伯糖异构酶（A）核酮糖核酮糖+ATP激酶（B）5-磷酸核酮糖+ADP5-磷酸核酮糖差向异构酶（D）5-磷酸木酮糖第73页，

49、共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一阿拉伯糖操纵子的特点如下：结构基因除araBAD之外，还有两个负责阿拉伯糖运入细胞的基因，即araE和araF，它们位于远离araBAD基因簇的地方。AraE和araF分别编码一个膜蛋白和一个位于细胞壁和细胞膜之间的阿拉伯糖结合蛋白。目前对这两个基因还了解不多，在此不作讨论。第74页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一调节基因是araC，它编码的araC蛋白既是正调节因子，又是负调节因子。araBAD和araC基因的转录分别在两条链上以相反的方向进行，它们各有各的启动子，araBAD的启动子是PBAD，araC的启动子是

50、PC。第75页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一araC蛋白在ara操纵子上有三个结合位点：araO1、araO2和araI。araO1位于-110 -140之间，此处正是araC基因聚合酶的结合位点，araC蛋白与该操纵基因的结合能有效的阻遏araC基因的转录；araO2位于-280附近，即在araC基因的前导序列中，它对araBAD基因的有效阻遏是不可缺少的；araI位于-78 -40处，它的下游方向与araBAD聚合酶的结合位点紧密相连，上游与cAMP-CAP结合位点紧密相连，这一位点与araBAD基因的激活和阻遏都有关系。第76页，共158页，2022年，5月20

51、日，9点57分，星期一ara操纵子也受cAMP-CAP的激活，所以对葡萄糖敏感。ara操纵子的诱导物是阿拉伯糖。第77页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一ara操纵子的调控机制如下：在没araC蛋白时，RNA聚合酶可与PC结合，转录araC基因，但此时PBAD不被激活。当细胞内araC蛋白积累时，与araO1结合，阻遏araC基因的转录。如果此时细胞内没有足够的cAMP，使cAMP-CAP结合位点空缺（即使有诱导物阿拉伯糖存在），一个araC二聚体同时与araO2和araI结合，形成噜噗结构，阻遏了araBAD基因的转录。第78页，共158页，2022年，5月20日，9点

52、57分，星期一当葡萄糖不足而阿拉伯糖存在时，细胞内cAMP浓度升高，cAMP-CAP复合物与其结合位点结合，对转录起促进作用；同时阿拉伯糖与araC蛋白结合，改变其构象，使araC蛋白放开araO2位点而不再成环，从而激活araBAD基因的转录。由此可见，两个小分子物质cAMP和阿拉伯糖对araBAD基因的高效表达都是必需的。 第79页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一1.2.5 色氨酸操纵子 大肠杆菌合成各种氨基酸所需酶的基因也是以操纵子的形式存在的。当细胞中缺乏某种氨基酸时，相应的合成酶基因即被诱导转录；而当氨基酸供应充足时，就不再需要这些合成酶，相应的操纵子就被阻遏

53、。色氨酸操纵子(trytophane operon)负责色氨酸的生物合成，它的激活与否完全根据培养基中有无色氨酸而定。当培养基中有足够的色氨酸时，这个操纵子自动关闭，缺乏色氨酸时操纵子被打开，trp基因表达。第80页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一色氨酸的生物合成分为5步完成。每个环节需要一种酶，编码这5种酶的基因是紧密连锁在一起的，所以5个基因被转录在一条多顺反子mRNA分子上，分别以trpE、trpD、trpC、trpB、trpA代表，编码了邻氨基苯甲酸合成酶、邻氨基苯甲酸焦磷酸转移酶、邻氨基苯甲酸异构酶、色氨酸合成酶和吲哚甘油-3-磷酸合成酶。第81页，共158页

54、，2022年，5月20日，9点57分，星期一trpE基因紧邻启动子区和操纵基因区，但在它和操纵基因之间还有前导区和弱化子区，前导区和弱化子区分别用trpL和trpa来代表（如图所示）。trp操纵子中产生阻遏物的基因是trpR，该基因距离trp基因簇很远。在trpR基因和trp基因簇之间还有一个trpS（编码色氨酰-tRNA合成酶），它和Trp-tRNATrp也参与trp操纵子的调控作用。trp操纵子的转录调控除了阻遏系统以外，还有弱化系统，我们将分别予以介绍。 第82页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一 1.2.5.1 trp操纵子的阻遏系统 trpR基因的产物是阻遏蛋白

55、。当细胞内色氨酸浓度较低时，该阻遏蛋白不会与操纵基因结合，trp基因开启，转录trp mRNA。当细胞内色氨酸浓度较高时，色氨酸与阻遏蛋白结合，引起阻遏蛋白构象的变化，使其活化为有活性的阻遏物，并与O区结合，使trp基因关闭，不转录trp mRNA，所以色氨酸是辅阻遏物。第83页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一有活性阻遏物与RNA聚合酶对DNA有竞争作用。体外实验证明，如果先加入阻遏物，则RNA聚合酶不能与DNA结合；如果先加入RNA聚合酶，则阻遏物不能与DNA结合。这可能是因为O基因与P基因有重叠的缘故。第84页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一

56、阻遏型操纵机制对色氨酸来说是一个一级开关，主管转录是否启动，可看作trp操纵子中的粗调开关。trp操纵子中对应于色氨酸生物合成的还有一个细调控，这种细调控主管已经启动的转录是否能继续下去。在这个系统中，酶的浓度根据氨基酸的变化而变化。这个细微调控是通过转录到达第一个结构基因之前的过早终止来实现的，由色氨酸的浓度来调节这种过早终止的频率。 第85页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一 1.2.5.2 弱化子的调控系统 弱化子（attenuator）是一种位于trpE基因之前的前导区的转录终止子。前导区编码mRNA的前导序列，该序列由特殊的RNA发卡环组成，发卡环之后还有8个连

57、续的尿嘧啶碱基，mRNA的合成通常就在此处停止。实验证明，缺失弱化子序列后，trp基因的表达可提高6倍，而且不论是在阻遏 细胞内还是在永久性突变的细胞内都是如此。第86页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一研究发现，色氨酸mRNA的5端有162个核苷酸的前导序列，当mRNA的合成启动后，只要培养基中存在一定量的色氨酸，转录就会不同程度地在这个区域终止，产生一个仅有 140 个核苷酸mRNA分子。这种转录终止作用是通过mRNA分子自我配对形成的终止发卡结构（不依赖因子的终止子）实现的。第87页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一对前导序列进行的序列分析表明

58、，其相应的mRNA的4个区段（分别以1、2、3、4表示）可以不同的方式进行碱基配对从而形成发卡环结构：1区和2区可形成发卡， 3区和4区形成发卡。3区和4区发卡的后面是8个连续的尿苷酸，表现出不依赖于因子的终止子特征（见图5-9A），这段序列就是弱化子。2区和3区形成另一发卡。2区和3区形成发卡时，3、4区配对的终止子结构被破坏（见图5-9B）。第88页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一除此之外，还发现前导序列的1、2区可编码一小段14肽（含有起始密码子AUG和终止密码子UAG），称为前导肽。前导肽的合成直接影响着弱化子结构的形成，从而决定着转录是否继续下去。前导肽有一个

59、明显的特点，在其第10和11位上有两个色氨酸残基，这两个色氨酸与转录的弱化作用是密切相关的。 第89页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一色氨酸的转录弱化作用是指由于前导肽的翻译调节，使前导序列中的弱化子形成可终止转录的终止子结构，从而使色氨酸操纵子基因表达受到抑制，它是色氨酸操纵子基因表达的一种精细调控。具体说来：在没有氨基酸存在时，前导肽不能合成，前导序列的RNA链以图5-9A的形式存在，3、4区配对形成终止子结构，转录在寡聚尿苷酸处终止。第90页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一如果环境中缺乏色氨酸，而有其他氨基酸存在，则前导肽翻译到色氨酸密码子

60、UGG处停止，核糖体占据1区的位置，2区与3区配对，RNA链以图5-10A的形式存在，所以不能形成转录终止信号，转录得以继续进行。环境中有足够的色氨酸存在或色氨酸生成过多时，前导肽被正常合成，这时核糖体占据1区和2区的位置，RNA链以图5-10B的形式存在，所以3区和4区配对，形成了转录的终止信号，mRNA的合成也就终止了。第91页，共158页，2022年，5月20日，9点57分，星期一可见，这种转录弱化作用的精细调节是通过转录和翻译的偶联实现的。正是由于转录和翻译的偶联，使前导肽在翻译的过程中可以影响仅仅“先行一步”的转录，对培养基中色氨酸的浓度作出精细的反应。在这种精细调节中，前导肽序列无