化学酶工程专业知识市公开课获奖课件

1、酶工程Enzyme Engineering第五章 化学酶工程第1页第1页第一节 酶分子化学修饰第二节 模拟酶第三节 抗体酶第四节 印迹酶第五章 化学酶工程第2页第2页第一节 酶分子化学修饰游离酶缺点：抗原性；稳定性差；活性不够高。第五章 化学酶工程第3页第3页广义：但凡通过化学办法和手段或是通过化学反应使酶分子结构发生改变技术或过程，都可称为酶化学修饰。狭义：酶化学修饰则主要是指在较温和条件下，以可控方式使酶同一些化学试剂发生特异反应，从而引起单个氨基酸残基或其功效基团发生共价化学改变过程。定义第一节 酶分子化学修饰第4页第4页酶化学修饰目的：人为地改变天然酶一些性质，创造天然酶所不具备一些优

2、良特性甚至创造出新特性，扩大酶应用领域。酶化学修饰后改变：改变活性部位构象。提升生物活性。增强酶稳定性。减少酶类药物抗原性。改变酶学性质。第一节 酶分子化学修饰第5页第5页酶化学修饰原理利用化学修饰剂所含有各种基团特性，直接或间接地通过一定活化过程与酶分子某种氨基酸残基发生化学反应，从而使酶分子结构发生改变。被修饰酶。修饰剂选择。修饰反应条件选择。第一节 酶分子化学修饰考虑原因第6页第6页 酶分子侧链基团化学修饰 酶分子表面化学修饰办法及修饰剂第一节 酶分子化学修饰第7页第7页采用一些可溶性大分子物质通过共价键将其连接到酶分子表面，使之在酶表面形成覆盖层，从而使酶性质发生改变，以满足人们需要。

3、惯用大分子修饰剂：聚乙二醇、右旋糖酐、糖肽、肝素、血清白蛋白。常见修饰办法：溴化氰法、高碘酸氧化法、戊二醛法、叠氮法、琥珀酸法、三氯均嗪法。酶分子表面化学修饰第一节 酶分子化学修饰第8页第8页酶分子侧链基团化学修饰酶蛋白侧链主要包括氨基、羧基、巯基、胍基、酚基等。侧链基团一旦改变将引起酶蛋白空间构象改变，从而改变酶特性和功效。第一节 酶分子化学修饰第9页第9页氨基化学修饰 （赖氨酸）乙酸酐2,4,6三硝基苯磺酸第10页第10页2,4二硝基氟苯碘乙酸氨基化学修饰 （赖氨酸）酶分子侧链基团化学修饰第11页第11页丹璜酰氯氨基化学修饰 （赖氨酸）酶分子侧链基团化学修饰第12页第12页羧基化学修饰 （

4、谷氨酸、天冬氨酸）碳二亚胺硼氟化三甲烊盐第13页第13页巯基化学修饰 （半胱氨酸）5,5/ - 二硫代 双（2-硝基苯甲酸）4,4/ - 二硫二吡啶对氯汞苯甲酸第14页第14页N - 乙基 马来酰亚胺2 - 氯汞 - 4 - 硝基苯酚巯基化学修饰 （半胱氨酸）第15页第15页组氨酸咪唑基化学修饰碘乙酸焦碳酸二乙酯酶分子侧链基团化学修饰第16页第16页精氨酸胍基化学修饰丁二酮1,2-环己二酮丁二酮1,2-环己二酮第17页第17页苯乙二醛精氨酸胍基化学修饰酶分子侧链基团化学修饰第18页第18页色氨酸吲哚基化学修饰2 羟基 5 - 硝基苄溴4 - 硝基苯硫氯第19页第19页酪氨酸残基和脂肪族氨基酸残

5、基羟基化学修饰N-乙酰咪唑酶分子侧链基团化学修饰第20页第20页丝氨酸残基-二异丙基氟磷酸酯四硝基甲烷酪氨酸残基和脂肪族氨基酸残基羟基化学修饰第21页第21页甲硫氨酸残基化学修饰甲硫氨酸亚砜过甲酸碘乙酰胺第22页第22页第23页第23页采用一些可溶性大分子物质通过共价键将其连接到酶分子表面，使之在酶表面形成覆盖层，从而使酶性质发生改变，以满足人们需要。惯用大分子修饰剂：聚乙二醇、右旋糖酐、糖肽、肝素、血清白蛋白。常见修饰办法：溴化氰法、高碘酸氧化法、戊二醛法、叠氮法、琥珀酸法、三氯均嗪法。酶分子表面化学修饰第一节 酶分子化学修饰第24页第24页聚乙二醇对酶修饰 （单甲氧基聚乙二醇MPEG）MP

6、EG均三嗪类衍生物MPEG1MPEG2第25页第25页聚乙二醇对酶修饰 （单甲氧基聚乙二醇MPEG）第26页第26页MPEG氨基类衍生物蜂巢型MPEG聚乙二醇对酶修饰 （单甲氧基聚乙二醇MPEG）第一节 酶分子化学修饰第27页第27页右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯对酶修饰右旋糖酐及右旋糖酐硫酸酯分子中多糖链上羟基经活化后可与酶分子上氨基结合。（右旋糖酐）第28页第28页羟基活化-溴化氰法第29页第29页羟基活化-高碘酸氧化法第30页第30页糖肽对酶修饰异氰酸法戊二醛法第31页第31页含有生物活性大分子对酶修饰肝素是一个含硫酸酯黏多糖，由氨基葡萄糖和两种糖醛酸构成，平均分子量0左右。肝素增长酶稳定性，

7、由于肝素在体内还含有抗凝血、抗血栓、降血脂等活性，极适合用来修饰血栓溶解酶而增长其疗效。第32页第32页碳二亚胺法第33页第33页三氯均嗪法第34页第34页蛋白质或其它大分子对酶修饰修饰剂：人血清白蛋白修饰办法：戊二醛法、羰二亚胺法、活化酯法活化酯法琥珀酸酐第35页第35页影响酶化学修饰原因反应时间影响分子量影响pH对化学修饰影响修饰剂与酶用量之比对修饰效果影响温度影响第一节 酶分子化学修饰第36页第36页修饰酶性质修饰酶稳定性得到提升-热稳定性、耐蛋白水解酶稳定性。修饰酶抗原性得到减少-PEG和人血清白蛋白效果明显。修饰酶半衰期得到延长-保持药用酶体内疗效修饰酶最适pH改变-在生理和临床应用

8、上含有主要意义。修饰酶动力学性质-Vmax没有改变，有些Km会增大。第一节 酶分子化学修饰第37页第37页概述模拟天然酶（生物酶）结构、特性、作用原理及其在生物体内化学反应过程，人工合成含有分子辨认和催化能力化合物质，称为模拟酶天然酶缺点：很容易受到各种物理、化学及生物影响而失活。第二节 模拟酶第38页第38页当前模拟酶研究方向：模拟酶金属辅基。模拟酶活性功效基。模拟酶高分子作用方式。模拟酶与底物作用。模拟酶性状。第二节 模拟酶第39页第39页酶学基础：Pauling稳定过渡态理论酶先结合底物，进而选择性地让底物稳定处于某一特定反应过渡态，减少反应活化能，从而加速反应速度。模拟酶理论基础：第二

9、节 模拟酶第40页第40页超分子化学基础-Pederson、Cram、Lehn提出：超分子形成源于底物和受体结合，这种结合基于非共价键互相作用，如静电作用、氢键和范德华力等。模拟酶理论基础：第二节 模拟酶第41页第41页模拟酶分类主-客体酶模型，包括环糊精、冠醚、穴醚、杂环大环化合物 分子印迹酶 抗体酶胶束酶模型肽酶半合成酶。依据模拟酶属性可分为：第二节 模拟酶第42页第42页环糊精是直链淀粉在芽孢杆菌产生环糊精葡萄糖基转移酶作用下生成一系列环状低聚糖总称，通常含有612个D-吡喃葡萄糖单元。环糊精中各葡萄糖单元均以1,4糖苷键结合成环，空间结构呈锥形圆环。环糊精外缘亲水而内腔疏水，因此能像酶

10、同样提供一个疏水结合部位。环糊精模拟酶第二节 模拟酶第43页第43页环糊精葡萄糖单元数量不同可分为(6个)，(7个)及(8个)环糊精三种 ，每个葡萄糖残基均呈现无扭曲变形椅式构象，葡萄糖单元均以1,4糖苷键结合成环，内有空穴，疏水。外缘亲水第44页第44页环糊精模拟酶所含有催化作用（活性）： 水解酶活性 核酸酶活性 转氨酶活性 桥联欢糊精仿酶氧化和水解酶活性 环糊精模拟酶第二节 模拟酶第45页第45页大环聚醚按结构可分为：冠醚、穴醚、球醚。冠醚是指含杂原子单环化合物，穴醚是指含杂原子双环化合物，球醚是指含有杂原子球状大环醚。大环聚醚模拟酶活性：水解酶活性肽合成酶活性大环聚醚及其模拟酶第二节 模

11、拟酶Lehn第46页第46页杯芳烃是由苯酚及其衍生物与甲醛缩合而成，分子上缘由苯环对位取代基构成，下缘紧密排列着酚羟基，中间是苯环构成富含电子疏水空腔，其上缘亲油，下缘亲水，可与中性分子和极性离子等各种物质结合。模拟水解酶活性。杯芳烃及其模拟酶第二节 模拟酶第47页第47页金属卟啉能够模拟以金属离子为辅基或辅酶天然酶。卟啉是含有四个吡咯分子大环聚合物，主要骨架是卟吩。金属卟啉分子含有以共轭大电子体系，金属原子价改变为基础氧化还原性质，因而可作为与分子氧相关氧化还原酶模拟酶。金属卟啉及其模拟酶第二节 模拟酶第48页第48页肽酶是模拟天然酶活性部位，人工合成含有催化活性多肽。环肽在分子辨认方面更含

12、有优势。肽酶1977年人工合成八肽Glu-Phe-Ala-Glu-Glu-Ala-Ser-Phe含有溶菌酶(lysozyme)活性，其活力可达到天然酶50%。第二节 模拟酶第49页第49页抗体酶催化特性含有催化化学反应能力单克隆抗体，称为抗体酶，又称为催化性抗体。抗体酶理论基础及研究背景酶催化机制：过渡态理论。（1946，Pauling）免疫诱导产生底物过渡态抗体，抗体含有催化性能（1969，Jencks）单克隆抗体技术发展。（1975，Kohler, Milstein）第一个催化酯水解抗体酶。（1986，Lerner, Schultz）第三节 抗体酶第50页第50页抗体酶特点能催化一些天然酶

13、不能催化反应有更高专一性和稳定性催化作用机制不同。抗体酶和非催化抗体作用比较反应特异性反应可逆性反应量效关系反应过程。第三节 抗体酶第51页第51页抗体酶催化作用机制过渡态理论抗体酶催化反应类型转酰基反应磷酸酯水解反应磺酸酯闭环反应Claisen重排反应脱羧反应金属螯合反应第三节 抗体酶第52页第52页抗体酶制备原则利用某一反应过渡态类似物作为免疫原，则可诱导得到催化该反应抗体酶。过渡态类似物结构稳定，可化学合成。当前制备抗体酶主要环节：依据催化目的，通过化学反应合成模型化合物（过渡态类似物），并与载体蛋白偶联成人工抗原，制备含有催化活性单克隆抗体。抗原设计是制备抗体酶关键。策略：利用抗体稳定

14、带电过渡态抗体作为熵阱抗体静电互补效应第三节 抗体酶第53页第53页当前制备抗体酶主要办法：依据催化目的，通过化学反应合成模型化合物（过渡态类似物），并与载体蛋白偶联成人工抗原，制备含有催化活性单克隆抗体。拷贝法化学诱变法。蛋白质工程技术。相同分子诱导法。共价抗原免疫法。抗体酶制备办法第三节 抗体酶第54页第54页利用过渡态类似物制备抗体酶抗体酶制备办法第三节 抗体酶第55页第55页使不也许发生化学反应称为也许。使苛刻条件下化学反应在温和条件下实现。选择性催化平行反应中某一反应。制备蛋白质氨基酸序列快速分析抗体酶。制备水解病毒蛋白抗体酶。指导未知酶寻找。为化学反应机理研究提供依据。抗体酶应用前

15、景第三节 抗体酶第56页第56页分子印迹原理以一个分子作为模板，在其周围用聚合物交联，当除去该分子时，聚合物中间留下与该分子形状相同空穴，这种空穴就有也许对该分子含有选择性辨认结合能力 。该化合物分子叫印迹分子，也叫模板分子。聚合物称为分子印迹聚合物。制备对某一化合物分子含有选择性辨认结合聚合物过程称为分子印迹（技术）第四节 印迹酶第57页第57页分子印迹原理第四节 印迹酶第58页第58页选定印迹分子和功效性单体，使两者发生互补反应；在印迹分子功效性单体复合物周围发生交联聚合；用抽提法从聚合物中除掉印迹分子。分子印迹技术普通过程：第四节 印迹酶第59页第59页分子印迹技术分类预组织法又称共价法

16、。印迹分子先通过共价键与功效性单体结合，聚合后再将共价键断裂除去印迹分子。功效单体：含有乙烯基硼酸、醛、胺、酚、醇等。共价化合物：硼酸酯、亚胺、希夫碱、缩醛酮等。特点：结合基团定位准确，对印迹分子选择性高；共价键结合较牢固，对印迹分子辨认和解离较慢。第四节 印迹酶第60页第60页又称非共价法。印迹分子与功效性单体自组织排列，以非共价键自发形成含有多个作用位点复合物。功效单体：丙烯酸、丙烯酰胺、含有乙烯基苯甲酸、苯乙酸、咪唑和吡啶类化合物。甲基丙烯酸特点：操作简朴易行，印迹分子易除去，分子辨认过程更靠近天然分子辨认系统，可同时采用各种功效单体，增长印迹效果；功效单体过量，选择性下降。分子印迹技术

17、分类自组装法第四节 印迹酶第61页第61页聚合时，印迹分子与功效基团共价结合。辨认时，印迹分子与功效基团非共价结合。金属离子配位办法印迹分子-金属离子-功效单体三维复合物进行交联聚合。金属配位作用强度可通过EDTA简朴变换金属离子种类实现对印迹分子聚合物亲和能力灵活调整。分子印迹技术分类自组装和预组织相结合办法第四节 印迹酶第62页第62页分子印迹聚合物制备功效性单体：羧酸类化合物（甲基丙烯酸、丙烯酸、乙烯基苯甲酸）、磺酸及杂环弱碱类（乙烯基吡啶、乙烯基咪唑），最惯用体系为聚丙烯酸和聚丙烯酰胺体系。交联剂：丙烯酸类交联剂（二亚乙基丙烯酸）溶剂：溶剂极性越大，产生辨认效果越弱（甲苯，二氯甲烷）低温聚合：可提升分子印迹聚合物分辨力。分子印迹聚合物形态：快、珠、薄膜、表面印迹、固定容器内就地聚合。第四节 印迹酶第63页第63页分子印迹酶含有催化能力（作用）