高产胞外多糖嗜热链球菌的筛选及其直投式发酵剂的应用

1、PAGE 9 -高产胞外多糖嗜热链球菌的筛选及其直投式发酵剂的应用乳酸菌胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)是指乳酸菌在菌体生长过程中产生并分泌到细胞外、常渗入到培养基中的一种天然高分子聚合物1。乳酸菌是公认的安全级(Generally Regarded As Safe,GRAS)、绿色食品微生物,其所产EPS也被认为是安全可靠的,具有多种生物活性,包括抗氧化、抗肿瘤、降血糖、增强免疫力以及调节肠道菌群等2-5。乳酸菌EPS在抗氧化方面的优良特性,使其可以作为一种安全、无毒和来源广泛的天然抗氧化剂,是目前研究的热点。此外,乳酸菌EPS具有的多种理化特性使其可以作为理想的稳定剂

2、和增黏剂应用于发酵食品中,起到改善乳制品口感、流变学特性和防止乳清析出的作用,使产品更稳定、质地更细腻6。目前从我国传统发酵食品中分离出的产EPS的乳酸菌有嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)、肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)和瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus)等7-9。其中S.thermophilus是链球菌属中唯一可应用在发酵食品中的菌株,是优良的基础发酵剂。目前高产EPS菌种资源相

3、对匮乏,导致其广泛的开发和应用受到限制。科学家们也试图用基因工程的手段构建高产EPS菌株,但目前仍未取得较大进展10。本研究拟从我国传统发酵食品中分离出高产EPS的乳酸菌,并进行分离提取,对LAB的生物学特性和其产EPS的抗氧化特性进行分析,同时探索乳酸菌制备的直投式发酵剂(directed vat set,DVS)在发酵乳中的应用。2.2 WHH3379生物学特性分析2.2.1 WHH3379生长特性由图3可知,嗜热链球菌WHH3379具有良好的生长情况和产酸速率,反映其较高的乳酸菌活力。嗜热链球菌WHH3379从2 h后快速生长进入对数生长期,6 h后即进入稳定期,显示出较快的生长速率；嗜

4、热链球菌WHH3379在接种2 h后开始大量产酸,pH下降迅速,8 h后趋于平稳,pH为4.10左右,显示出优良的产酸速率。a-生长曲线；b-产酸曲线图3 嗜热链球菌WHH3379的生长曲线和产酸曲线Fig.3 Growth and acid production curves ofS.thermophilusWHH33792.2.2 WHH3379耐酸耐胆盐特性益生菌必须以活菌形态到达人体消化道才能更好的发挥其益生功能,而胃部的低pH环境会影响益生菌在肠道的定植18,所以对酸的耐受性是衡量优良益生菌的重要指标。嗜热链球菌WHH3379的耐酸能力如图4-a所示,随着pH值的降低和培养时间的增加

5、,菌株存活率有所降低。但是,在pH为2.5、3.5和4.5的酸度下孵育1 h后菌株存活率均95%,孵育4 h后菌株存活率仍均89%。再将pH进一步降低到1.5后,嗜热链球菌WHH3379孵育4 h后仍表现出了(72.851.18)%的存活率。从传统酸奶分离出的鼠李糖乳杆菌217-3在pH 1.5孵育4 h后的存活率为72%,来源于酵素液体的菌株B1在pH 1.5孵育4 h后的存活率为(95.573.07)%19。正常人体胃液的pH值在1.54.5波动变化,菌株可在pH 1.54.5维持较高的存活率,表明嗜热链球菌WHH3379具有优良的酸耐受性。a-酸耐受性；b-胆盐耐受性图4 嗜热链球菌WH

6、H3379对酸、胆盐的耐受性测定Fig.4 Tolerance ofS.thermophilusWHH3379 to acids and bile salts可以耐受人体小肠环境中的胆盐胁迫是衡量优良益生菌的重要指标,也是益生菌发挥功能的重要前提。嗜热链球菌WHH3379的耐胆盐能力如图4-b所示,随着胆盐浓度的增加和培养时间的增加,菌株存活率有所下降。嗜热链球菌WHH3379在胆盐含量为0.03%和0.1%的条件下孵育24 h后菌株存活率仍均85%,在胆盐含量为0.3%的环境下培养4、8和24 h后的存活率分别为(90.831.05)%、(81.333.11)%和(73.411.45)%。植

7、物乳杆菌KLDS 1.0318在0.3%胆盐培养4 h后的存活率仍可达95.40%18,高于本研究中EPS的清除率。正常人体小肠的胆盐浓度在0.03%0.3%波动19,菌株在胆盐含量为0.03%0.3%的条件下能够维持较高水平的存活率,表明嗜热链球菌WHH3379具有较好的胆盐耐受性。2.3 WHH3379 EPS体外抗氧化活性分析2.3.1 DPPH自由基清除能力的测定菌株及其产物对DPPH自由基的清除作用可反映其降低过氧化自由基、烷自由基或脂质自由基连锁反应的能力21。如图5所示,随着WHH3379 EPS质量浓度的增加,对DPPH自由基清除能力也不断增加,表现出浓度依赖特征,但始终低于维

8、生素C的清除率,当维生素C质量浓度为1 mg/mL时,清除率即可达到(90.31.35)%。当WHH3379 EPS质量浓度为5和8 mg/mL时,对DPPH自由基的清除率分别为(70.41.13)%和(79.92.26)%。假肠膜明串珠菌GX-3 EPS在质量浓度为5 mg/mL 时的清除率最大为65.34%22,德式乳杆菌 EPS在质量浓度为5 mg/mL时的DPPH清除率为68.60%23,均低于本研究中EPS对DPPH自由基的清除率。图5 WHH3379 EPS对DPPH自由基的清除能力Fig.5 DPPH radical scavenging capacity of WHH3379

9、EPS2.3.2 OH清除能力的测定OH是最具反应活性和最危险的自由基,可通过活体免疫作用产生,对细胞和生物分子造成严重氧化应激损伤,从而导致衰老、癌症等疾病24。如图6所示,0.22 mg/mL质量浓度的WHH3379 EPS对OH的清除能力维生素C。当WHH3379 EPS质量浓度为5和8 mg/mL时,对OH的清除率分别(68.90.98)%和(73.61.58)%,显示出良好的抗氧化性。融合魏斯氏菌H2产EPS对OH的清除能力随EPS浓度的增加而提高,在5 mg/mL时的清除率为(42.560.16)%16。图6 WHH3379 EPS对OH的清除能力Fig.6 Hydroxyl ra

10、dical scavenging capacity of WHH3379 EPS清除能力的测定是活性自由基的前体物质,可以与生物活性分子发生反应,造成脂质、DNA和蛋白质等的氧化损伤25。如图7所示,随着WHH3379 EPS浓度的增加,对的清除率呈现不断提高后保持平稳的趋势,但始终低于维生素C。在WHH3379 EPS质量浓度为5和8 mg/mL时,对清除率达到(60.30.21)%和(61.01.38)%。叶广彬等23研究发现假肠膜明串珠菌GX-3 EPS在质量浓度为5 mg/mL时对的清除率最大为(77.482.45)%,高于本研究EPS对的清除率。图7 WHH3379 EPS对的清除能

11、力Fig.7 Superoxide anion radical scavenging capacity of WHH3379 EPS2.3.4 总还原力的测定EPS可以通过提供氢原子的方式来阻断过氧化物的形成,破坏自由基反应链,防止氧化损伤,从而达到抗氧化效果。如图8所示,WHH3379 EPS的总还原力与样品浓度呈正相关,但始终低于维生素C。WHH3379 EPS在质量浓度为5和8 mg/mL时,其总还原力为(1.2340.35)和(1.2130.88),显著高于戊糖片球菌 SR2-2的EPS26。图8 WHH3379 EPS总还原力Fig.8 Total reducing power of

12、 WHH3379 EPS2.4 DVS的制备和应用由高产EPS的嗜热链球菌WHH3379制得DVS,平板计数得嗜热链球菌WHH3379冻干菌粉活菌数为1.31011CFU/g,达到发酵剂的活性要求。利用DVS发酵7 h得到的酸乳pH值为(4.420.15),酸度为(75.002.34)T,拉丝长度可达(28.851.24)cm,黏度为(5 4862.25)mPas和活菌数为1.89108CFU/mL(表2)。该发酵剂生产的发酵乳酸度适宜、产黏性好、感官评价高且后酸化现象不明显(图9),可作为一种功能性DVS应用于发酵食品中。表2 WHH3379的发酵乳特性Table 2 Characteris

13、tics of milk fermented by WHH3379 DVS图9 WHH3379发酵乳产酸曲线Fig.9 Acid production curve in WHH3379 fermented milk3 讨论乳酸菌EPS可作为稳定剂和增稠剂应用于乳品行业,起到改善乳制品质构和口感的作用,此外还具有抗氧化、抗肿瘤、增强免疫力及调节肠道菌群等多种益生功能12。EPS产量受到菌株类型、培养条件和培养基成分等因素的影响11。根据EPS产量可以将乳酸菌分为高产(180 mg/L)、中产(120180 mg/L)和低产(120 mg/L)EPS菌株27。本研究得到的嗜热链球菌WHH3379利

14、用脱脂乳基料发酵得到的EPS产量为(526.582.91)mg/L,说明嗜热链球菌WHH3379是1株高产EPS的乳酸菌。乳酸菌EPS在抗氧化方面的巨大潜力,使其可以作为一种安全、有效、无毒和来源广泛的天然抗氧化剂。其体外抗氧化功能主要通过清除体内各种自由基来实现,体内抗氧化功能主要通过提高机体抗氧化酶活性和增强机体抗脂质过氧化的作用来完成28。本研究中,嗜热链球菌WHH3379的EPS质量浓度在8 mg/mL时,对DPPH自由基、OH和的清除率分别为(79.92.26)%、(73.61.58)%和(61.01.38)%,总还原力为(1.2130.88),具有较好的抗氧化功能。发酵乳具备的营养

15、和益生功能越来越受到消费者的青睐,其市场需求量的增加也对相应发酵剂的稳定性和功能性提出要求。优良的发酵剂应该具有产酸快、产黏高、后酸化稳定和活菌数高等特点。本研究中由嗜热链球菌WHH3379制备的DVS得到的发酵乳黏度高,组织状态好,后酸化平缓,拉丝长度为(28.851.24)cm,黏度为(5 4862.25)mPas,酸度为(75.002.34)T和活菌数为1.89108CFU/mL,同时嗜热链球菌WHH3379 EPS又具有抗氧化功能,可作为一种功能性DVS应用于发酵食品中。4 结论本研究从青海农家自制酥油样品中分离得到1株高产EPS乳酸菌,经形态学鉴定、生理生化实验和分子生物学实验,鉴定该菌株为S.thermop