基于RNAi的害虫控制方法

1、基于RNAi的害虫控制方法基于RNAi的害虫控制方法内容提要研究背景RNAi靶基因的筛选基于RNAi的害虫控制技术小结与展望2内容提要研究背景4一、研究背景3一、研究背景5研究背景RNAi技术可望解决杀虫谱的专一性问题害虫控制的关键效 果安全性杀虫谱的宽窄物种水平群体水平杀虫谱：广谱选择性专一性安全性好！RNAi技术特异性沉默靶标基因靶标害虫的专一性控制4研究背景RNAi技术可望解决杀虫谱的专一性问题害虫控制效 RNAi简介RNAi技术作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具，正在功能基因组学领域掀起一场新的革命，并将彻底改变这个领域的研究步伐。为此被Science评为2002年十大科学突破

2、之首(2001年为第2，2003年为第4)。RNAi是植物、动物（含昆虫）、线虫、真菌等真核生物的一种强有力的基因表达抑制途径，主要通过dsRNA被核酸酶切割成21-25nt的干扰性小RNA（small interference RNA, siRNA）, 介导识别并靶向切割同源性靶mRNA分子而实现沉默靶基因的作用。Andrew Z. Fire教授，1959年生，因为1998年首先发现RNAi现象，于2006年获Nobel医学奖 5RNAi简介RNAi技术作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗68dsRNA的主要导入方法注射法（injection）：注射dsRNA或siRNA 应用最广，用于基因

3、功能研究等浸泡法（soaking）：浸泡虫体于dsRNA或siRNA溶液 仅在线虫Caenorhabditis elegans中成功饲喂法（feeding）：喂食dsRNA溶液或表达dsRNA的细菌 线虫C. elegans中成功，1998 ,Timmons & Fire, Nature 果蝇中未成功，2000 planarians (2003，PNAS) 2007年以来，棉铃虫、玉米根萤叶甲、甜菜夜蛾转基因植物法（transgenic plants): 把目标基因的dsRNA转入植物中 棉铃虫、玉米根萤叶甲、甜菜夜蛾 7dsRNA的主要导入方法注射法（injection）：注射ddsRNA的

4、主要导入方法（续）dsRNA的导入方法注射法转基因植物介导法微生物介导法浸泡法饲喂法饲喂法是筛选靶标基因最便利的方法8dsRNA的主要导入方法（续）dsRNA的注射法转基因植物微只有饲喂法、转基因植物等方法才有可能应用于害虫控制9只有饲喂法、转基因植物等方法才有可能应用于害虫控制11昆虫RNAi论文的数量统计10昆虫RNAi论文的数量统计12昆虫的饲喂法RNAi 至2010年初，共报道13种昆虫的饲喂法RNAi可行。11昆虫的饲喂法RNAi 至2010年初，共报道13种昆虫昆虫的饲喂法RNAi（续）PLoS ONE, 2009; Insect Mol Biol, 201012昆虫的饲喂法RNA

5、i（续）PLoS ONE, 2009; I褐飞虱的饲喂法RNAi技术Double-deck of Parafilmartificial diet + dsRNAartificial diet + dsRNADouble-deck of Parafilmdaily replaced: artificial diet and dsRNA13褐飞虱的饲喂法RNAi技术Double-deck of Pa基于RNAi的害虫控制安全性作用机制靶标基因应用技术14基于RNAi的害虫控制安全性作用机制靶标基因应用技术16二、RNAi靶基因的筛选效果好安全性好15二、RNAi靶基因的筛选效果好安全性好17RNA

6、i靶基因的筛选标准安全性好 什么叫做安全性好？指标？效果好 什么叫做效果好？ 指标：死亡率高？繁殖力低？ 短期？长期？16RNAi靶基因的筛选标准安全性好181、昆虫生长调节剂的靶标蜕皮激素、保幼激素几丁质代谢酶其它昆虫特有的蜕皮、变态等发育过程171、昆虫生长调节剂的靶标蜕皮激素、保幼激素昆虫特有的蜕皮、变（1）昆虫几丁质合成酶基因A 非中肠基因：甜菜夜蛾几丁质合成酶基因A (SeCHSA)包括21个外显子和20个内含子，其中第17外显子是一个交替外显子。安全性：不存在于高等生物中。Insect Biochem Mol Biol, 200718（1）昆虫几丁质合成酶基因A 非中肠基因：甜菜夜

7、蛾几丁质合成 几丁质合成通路几丁质通路中包括：海藻糖酶（海藻糖合成酶）,己糖激酶, 葡萄糖-6-磷酸异构酶, 果糖-6-磷酸转氨酶, 葡糖胺-6磷酸-N-乙酰转氨酶, 磷乙酰氨基葡萄糖变位酶, UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶和 几丁质合成酶。(Kramer et al., 1986)19 几丁质合成通路几丁质通路中包括：(Kramer et a发现昆虫非中肠基因可作为RNAi的靶标基因Insect Biochem Mol Biol, 2007; Bull Entomol Res, 2008; PLoS ONE, 2009几丁质合成酶基因A 非中肠表达基因 昆虫几丁质 合成通路的 关键基因成功

8、沉默了该基因，并获得死亡表型。科学意义大大拓宽了靶标基因的来源提示昆虫体内存在干涉RNA的传导机制20发现昆虫非中肠基因可作为RNAi的靶标基因Insect Bi良好的RNAi效果： mRNA 存活率 畸形 *21良好的RNAi效果：*23RNAi导致害虫表皮和气管畸形幼虫蜕皮一半22RNAi导致害虫表皮和气管畸形幼虫蜕皮一半24产卵量无显著差异孵化率显著降低几丁质合成酶基因A被干涉后的产卵量和孵化率（未发表数据）23产卵量无显著差异孵化率显著降低几丁质合成酶基因A被干涉后的产卵数量差异不明显卵发育程度有差异dsCHSAcontrolmiR-2703dsCHSAcontrol几丁质合成酶基因A

9、被干涉后的卵巢发育（未发表数据）24卵数量差异不明显dsCHSAcontrolmiR-2703d(2)海藻糖合成酶基因 褐飞虱海藻糖合成酶基因在脂肪体，卵巢，中肠中都有表达。安全性：不存在于脊椎动物中。RNAi后，酶活力和害虫（褐飞虱）存活率均显著降低。存活率组织分布 Insect Mol Biol, 201025(2)海藻糖合成酶基因 褐飞虱海藻糖合成酶基因在脂肪体，卵巢(3)蜕皮激素受体基因 功能：调控昆虫发育、变态及繁殖等生命过程。安全性：昆虫特有。RNAi后，甜菜夜蛾存活率下降至5%左右。PLoS ONE, 2010（甜菜夜蛾）26(3)蜕皮激素受体基因 功能：调控昆虫发育、变态及繁殖

10、等生命 蜕皮激素受体被RNAi后，棉铃虫的死亡率达60%PLoS ONE, 201227 蜕皮激素受体被RNAi后，棉铃虫的死亡率达60%PLoS 褐飞虱的死亡率也超过70%28褐飞虱的死亡率也超过70%30蜕皮激素受体被RNAi后，繁殖力下降Offspring per pair decreased after feeding on diet with dsNlEcR-c for 10 days. Int. J. Boil. Sci, 201429蜕皮激素受体被RNAi后，繁殖力下降Offspring pe2、其它靶标基因302、其它靶标基因32snf7基因死亡率高Monsanto公司：snf

11、7是由226个氨基酸组成的蛋白。它是转运必需内体分选复合物（endosomal sorting complex required for transport，ESCRT ）的一个组成部分，是一个至关重要的基因参与真核生物的生长发育过程。31snf7基因死亡率高33对玉米根萤叶甲的控制效果PLoS ONE, 201232对玉米根萤叶甲的控制效果PLoS ONE, 201234三、基于RNAi的害虫控制技术33三、基于RNAi的害虫控制技术35前景： Bt作物 + 基于RNAi的转基因作物1、转基因植物34前景： Bt作物 + 基于RNAi的转基因作物转昆虫基因dsRNA的玉米可显著减轻害虫的危害

12、Monsanto公司Nat Biotech., 200735转昆虫基因dsRNA的玉米可显著减轻害虫的危害Monsant转棉铃虫蜕皮激素受体基因的烟草1周3周PLoS ONE, 201236转棉铃虫蜕皮激素受体基因的烟草1周3周PLoS ONE, 2 pSK-NlEcR-c 3790bpintermediate vector expression vector Restriction Enzyme digestion LigationGenerated GM rice by ATMT (mediated by LBA4404)水稻品种：日本晴GM riceSense arm(362bp)Ant

13、isense arm(371bp)转褐飞虱蜕皮激素受体基因的水稻Int. J. Boil. Sci, 201437 pSK-NlEcR-cexpression vec蜕皮激素受体基因（EcR）的控害效果饲喂转褐飞虱EcR基因水稻后，褐飞虱的死亡率仅为10%左右，但繁殖力却减少了22.78%-77.83%，而且出现致死表型。38蜕皮激素受体基因（EcR）的控害效果饲喂转褐飞虱EcR基因水转snf7基因的转基因玉米的田间试验三者合一：Bt+抗除草剂+snf7 的RNAi特异性好田间防治效果好（Monsanto公司）39转snf7基因的转基因玉米的田间试验三者合一：Bt+抗除草剂2、微生物介导的RNAi技术昆虫杆状病毒Bt等细菌绿僵菌等真菌402、微生物介导的RNAi技术昆虫杆状病毒42四、小结与展望41四、小结与展望434244小 结RNAi技术在害虫控制中具有广阔的应用前景，可实现物种专一性控制。需要加强RNAi靶标基因的筛选：安全性、控害效果。转基因植物和微生物介导的RNAi技术有望在不久的将来实现产业化。43小 结RNAi技术在害虫控制中具有广阔的应用