BIORAD脉冲场电泳介绍

1、脉冲场电泳介绍（PFGE）BIORAD脉冲场电泳介绍第1页一、脉冲场电泳（PFGE）原理二、脉冲场电泳（PFGE）操作流程三、脉冲场电泳（PFGE）应用主要内容BIORAD脉冲场电泳介绍第2页脉冲场电泳（PFGE）原理核酸凝胶电泳: 核酸凝胶电泳是重组DNA技术关键技术之一，它能够按分子量大小对DNA或RNA进行分离。所以，可用于分离、判定和纯化DNA或RNA片段，也是许多分子生物学研究方法，如DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析、凝胶回收等等一系技术技术基础。BIORAD脉冲场电泳介绍第3页惯用核酸凝胶电泳有琼脂糖(Agarose)凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。

2、能够在水平或垂直电泳槽中进行。 脉冲场电泳（PFGE）原理BIORAD脉冲场电泳介绍第4页脉冲场电泳（PFGE）原理琼脂糖凝胶分辨DNA片段范围为0.2-50 kb之间。聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为1-1, 000 bp之间。凝胶浓度高低影响凝胶介质孔隙大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。BIORAD脉冲场电泳介绍第5页浓 度（%）标 准(kb)高强度(kb)低熔点(kb)低黏度低溶点(kb)0.31500.50.7250.80.5150.8100.8101.00.25120.480.481.20.1560.370.371.50.0840.240.242.00.130.133.00.051

3、0.514.00.10.56.00.010.1不一样类型琼脂糖分离DNA片段范围脉冲场电泳（PFGE）原理BIORAD脉冲场电泳介绍第6页脉冲场电泳（PFGE）原理丙烯酰胺浓度（%）有效分离范围（bp）二甲苯氰FF溴酚蓝3.510004601005.080500260658.0604001604512.040200702015.025150601520.061004512DNA在聚丙烯胺凝胶中有效分离范围BIORAD脉冲场电泳介绍第7页脉冲场电泳（PFGE）原理 在凝胶电泳中或后，加入溴化乙锭（Ethidium bromide，EtBr）染料对核酸分子进行染色，然后放置在紫外光下观察，可灵敏而

4、快捷地检测出凝胶介质中DNA谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05g微量 DNA，也能够被清楚地检测出来。BIORAD脉冲场电泳介绍第8页普通核酸电泳应用：1、分子克隆-PCR产物特异性确实认2、RNA完整性确实认（定量PCR验证步骤）脉冲场电泳（PFGE）原理BIORAD脉冲场电泳介绍第9页脉冲场电泳（PFGE）原理 脉冲场凝脉电泳 (Pulsed field gelelectrophoresis,PFGE),是近年发展起来一个主要分离大分子量线性DNA分子电泳技术。 普通琼脂糖凝胶电泳分离DNA分子上限是50 kb 大于该极限DNA分子,常规琼脂糖凝胶便失去了其分子筛作用,造成电泳带型

5、无法分辨，PFGE创造恰好处理了这一问题。BIORAD脉冲场电泳介绍第10页脉冲场电泳（PFGE）原理1984年, Schwartz和Cantor首次用此技术成功分离得到酿酒酵 母菌(Saccharomyces cerevisiae)细胞16条完整染色体DNA。今后,伴随PFGE技术不停改进,现已含有分辨出高达10Mb级DNA能力。这一独具高分辨力使PFGE应用范围已包括到几乎全部生物基因组结构研究。BIORAD脉冲场电泳介绍第11页 PFGE基本原理是对琼脂糖凝胶外加交变脉冲电场,其方向、时间和电流大小交替改变,每当电场方向发生改变时,大分子DNA便滞留在凝胶孔内,直至沿新电场轴重新定向后,

6、才能继续向前泳动,DNA分子越大,这种重新定向需要时间就越长,当DNA分子改变方向时间小于脉冲时间时,DNA就能够按照其分子量大小分开,经EB染色后在凝胶上出现按DNA大小排列电泳带型。 这种电泳技术促进了癌症研究、食品安全、公共健康、品质控制和基因组作图进步。脉冲场电泳（PFGE）原理PFGE原理BIORAD脉冲场电泳介绍第12页PFGE普通核酸电泳脉冲场电泳（PFGE）原理BIORAD脉冲场电泳介绍第13页BIO-RAD 脉冲场电泳型号选择 脉冲网试验室使用BIO-RAD脉冲场电泳系统分离菌株DNA，电泳完成后凝胶用EB染色，然后用BIO-RAD分辨率更高成像仪采集和处理图像，并制成TIF

7、F 格式，使用带数据共享工具Fingerprinting 软件或BioNumeric软件进行分析。该模式成功地应用于细菌性传染疾病溯源及监控。 BIORAD脉冲场电泳介绍第14页CHEF-DR IIIBIORAD脉冲场电泳介绍第15页脉冲场电泳系统配件BIORAD脉冲场电泳介绍第16页脉冲场电泳（PFGE）试验流程BIORAD脉冲场电泳介绍第17页全部培养细胞用琼脂糖包被，防止后续处理过程中DNA被剪切琼脂糖和细胞混合物注入制样模块中， (1.5mm x 10mm x 5mm)，凝固后，胶块能够从制样模块中取出。（2）细胞壁裂解，蛋白消化Proteinase K胶块在细胞裂解液和蛋白酶K溶液中

8、处理Agarose（1） 细胞包被DNACellular ProteinCell Wall制好胶块，能够在1天内或4天中进行后续处理脉冲场电泳（PFGE）操作流程BIORAD脉冲场电泳介绍第18页胶块制备: 常规DNA制备方法得不到完整大分子量DNA,因为DNA大片段很脆弱,轻易因提取过程中机械作用如吸打、离心等而造成DNA断裂。脉冲场电泳（PFGE）操作流程 为了得到完整大量DNA大片段,当前主要是采取低熔点琼脂糖(Lowmelting point agarose)包埋样品,再进行原位裂解和去蛋白处理从而释放DNA。 低熔点琼脂糖在这个过程中阻止了机械力对DNA大片段剪切作用,因而细胞裂解所

9、释放DNA大片段包埋在胶块中。制作好样品插块能够在电泳时直接插入加样孔中。BIORAD脉冲场电泳介绍第19页（3） DNA酶切Rare Cutting Restriction Enzyme16hr 用不惯用限制性内切酶消化DNA，产生15-20 条带，能够清楚判别亚型（4）上样、电泳(Side view of agarose gel)脉冲场电泳（PFGE）操作流程BIORAD脉冲场电泳介绍第20页脉冲场电泳（PFGE）操作流程BIORAD脉冲场电泳介绍第21页（5） 染色，观察结果(6) 结果分析DNA用EB 染色，在紫外下观察结果。电泳条带被凝胶图象仪统计下来，能够和数据库资料做比较。 比较

10、结果能够在不一样试验室之间共享。脉冲场电泳（PFGE）操作流程BIORAD脉冲场电泳介绍第22页影响PFGE 结果原因影响PFGE试验结果原因：脉冲角度（ Pulse / Reorientation Angle ）脉冲转化时间和转化速率（ Switch Time and Switch Time Ramping ）电压梯度（ Voltage Gradient ）缓冲液类型、浓度和温度（ Buffer Type, Concentration, and Temperature）琼脂糖类型和浓度（ Agarose Type and Concentration ）运行时间（ Run Time ）脉冲场电

11、泳（PFGE）操作流程BIORAD脉冲场电泳介绍第23页 PFGE含有独特分离大片段DNA能力,是一个分析染色体DNA强有力工具。当前PFGE主要应用于染色体DNA分离、微生物基因分型、DNA辐射损伤修复、细胞凋亡、酵母人工染色体电泳分析及单向电场泳难以分辨DNA图谱制作等研究中。脉冲场电泳（PFGE）应用BIORAD脉冲场电泳介绍第24页脉冲场电泳（PFGE）应用分子分型一、PFGE在分子分型方面应用 经过微生物分型能够判定菌株是否一致、比较它们亲缘关系,对于细菌性传染病监测、传染源追踪、传输路径调查和识别有着非常主要意义。 传统微生物分型技术主要是基于表型特征分类,如生化分型(biotyp

12、ing)、血清学分型(serotyping)、耐药谱测定(antmi icrobial susceptibility testing)、噬菌体分型(bacterialphage typing)等。因为微生物易受环境影响,很轻易改变其表示性状,使得表型分类很不准确。 近年来伴随分子生物学技术发展,基因分型技术日渐受到青睐。当代分子分型技术主要有:基于限制性内切酶分型技术:PFGE分型和RFLP分型;基于PCR分型技术:RAPD分型、Rep-PCR分型、AFLP分型;基于核苷酸序列分析分型技术:SLST分型和MLST分型。BIORAD脉冲场电泳介绍第25页微生物表型分型与分子分型方法对比项目表型分

13、型分子分型方法依据表型特征遗传特征方法举例生物分型、血清分型、噬菌体分型、耐药性分析质粒分型、PFGE、核糖体分型、基于PCR方法、基于测序方法（MLST、VNTR、MLVA）优点成熟可靠数据库，作为初级分型仍在常规使用高分辨率，可重复性，易于标准化及自动化缺点低分辨率、不可重复，并不适适用于全部病原体缺乏病原体历史数据、成本高1.表型和分子分型各有优缺点；对于罕见血清型菌株，表型可发挥主要作用2.分子分型方法各有优缺点，各有适用性，联合使用是主流3.试验方法和结果质量确保是任何分析网络最关键部分BIORAD脉冲场电泳介绍第26页PFGE分型技术因其重复性好、分辩力强被誉为细菌分子分型技术“金

14、标准”,并推荐作为金黄色葡萄球菌等病原微生物分型标准技术。PFGE分型技术不足是:耗时,需要24 d样品制备时间;设备价格昂贵；对分析大小相同片段分辨力不是很高。当前,美国PulseNet已创建病原菌PFGE图谱数据库,经过与数据库中病原菌PFGE图谱比较,能够判断菌株间染色体DNA相同程度。脉冲场电泳（PFGE）应用分子分型BIORAD脉冲场电泳介绍第27页脉冲场电泳（PFGE）应用分子分型BIORAD脉冲场电泳介绍第28页 Tenover等提出了相关PFGE图谱与测定菌株相关性判别标准,依据电泳条带可分为:如PFGE图谱一致,说明为相同菌株;有13条带差异说明菌株间有相近关系,且只有单基因

15、改变;46条带差异说明菌株间可能有相近关系,表示出有2个独立基因差异;如菌株间有6条或更多条带差异,说明有3个或更多基因差异,视为无相关性。 该标准有一定不足。因为细菌高变异性,判断是否是同一菌株时允许一定变异存在。Fred在解释PFGE图谱时提出85%以上条带相同为相同菌株,50%以上条带不相同为不一样菌株。脉冲场电泳（PFGE）应用分子分型BIORAD脉冲场电泳介绍第29页PulseNet大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、李斯特菌、弯曲杆菌BIORAD脉冲场电泳介绍第30页PulseNetBIORAD脉冲场电泳介绍第31页PulseNetBIORAD脉冲场电泳介绍第32页PulseNetBIO

16、RAD脉冲场电泳介绍第33页PulseNetBIORAD脉冲场电泳介绍第34页加强公共卫生试验室和流行病学合作（1）建立参比试验室和流行病学之间常规和快速信息共享如每七天例会经过试验室支持针对暴发流行病学调查检测流行病学调查假设样本来自病人样本高度怀疑致病源，如食物、水病原体分子分型共同讨论，确定很好分型方法血清分型抗生素耐药性分析分子分型，如脉冲场凝胶电泳（PFGE）BIORAD脉冲场电泳介绍第35页建立试验室质量控制体系如外部质量控制系统（EQAS）引入区域或WHO全球性监测网络，如全球食源性疾病监测网络Regional centers 区域中心EQAS of WHOs GFN Count

17、ry data bank 国家数据库Electronic list serve 电子目录服务器增强公共卫生试验室和流行病学合作（2）BIORAD脉冲场电泳介绍第36页 基因组文库是将细胞核DNA酶切或随机打断成一定大小片段，然后将全部片段随机地连接到各种基因载体上，再转移至适当宿主细胞中，经过宿主细胞大量繁殖而形成各个片段无性繁殖系总集。大片段基因组文库包含噬菌体、YAC、BAC、Cosmid和Fosmid等文库，主要依据他们插入片段大小和构建载体不一样而进行分类。当前几乎全部模式物种及许多主要濒危物种都已建立了基因组文库。 构建基因组文库也是全基因组测序中一项主要工作，建立不一样长度插人片段

18、基因组文库，为全基因组序列拼接组装及基因组物理图谱绘制提供必要条件。普通在De Novo全基因测序中应用最多是插入片段为约100 KbBAC文库和40 Kb左右大小插入片段Fosmid文库，已经有大量文件报道。构建BAC或Fosmid文库时，其插人片段长度都已超出普通电泳分离阈值，而PFGE技术应用有效地处理了这一难题。脉冲场电泳应用构建基因组文库中应用BIORAD脉冲场电泳介绍第37页文库构建中主要有以下几个方面需要应用到PFGE技术：特定长度DNA插入片段分离，已分离DNA插入片段大小判定，建库质量判定(包含大小及稳定性判定)。图1简明演示了两种文库构建流程及PFGE在其中应用。脉冲场电泳

19、应用构建基因组文库中应用BIORAD脉冲场电泳介绍第38页二、PFGE在DNA辐射损伤和修复研究中应用 在电离辐射作用下,DNA分子将产生各种类型损伤,包含碱基损伤、DNA单链断裂(SSB)和双链断裂(DSBs)、DNA-DNA交联以及DNA-蛋白质交联等。辐射生物效应分子模型提出者Leenhouts和Chadwick认为,电离辐射诱发许多细胞效应均与DNA双链断裂相关,所以DSB及其修复一直是研究热点。脉冲场电泳应用DNA辐射损伤和修复BIORAD脉冲场电泳介绍第39页早期研究DSB方法主要有粘弹性测量法、速度沉降法、中性滤膜洗脱法,这些方法稳定性差,灵敏度低。伴随PFGE出现,辐射引发DN

20、A断裂过程才得到了详细研究。利用PFGE能够测量DNA双链断裂后DSBs分布，研究辐射引发DNA断裂片段释放百分比(FAR)和DNA断裂片段平均长度随照射剂量改变规律。脉冲场电泳应用DNA辐射损伤和修复BIORAD脉冲场电泳介绍第40页脉冲场电泳应用DNA辐射损伤和修复BIORAD脉冲场电泳介绍第41页PFGE技术优点在于灵敏度高,还能够提供DSB片段大小信息,是检测电离辐射所致DNA双链断裂及修复敏感方法。不过该方法只能对双链断裂是否作出判断,不能对DSBs进行量化,同时对检测低剂量辐射引发双链断裂无能为力。脉冲场电泳应用DNA辐射损伤和修复BIORAD脉冲场电泳介绍第42页三、PFGE在细胞凋亡研究中应用 细胞凋亡(apopto-sis)又称细胞程序性死亡(PCD),是在一定生理或病理条件下,为了更加好地适应生存环境而采取一个由基因控制、细胞主动、有序死亡过程。因为细胞凋亡与胚胎发育、免疫耐受和许多疾病产生等方面有着极为亲密关系,所以,细胞凋亡机理研究已成为生物学领域研究热点之一。所以,凋亡检测技术也显得尤为主要。脉冲场电泳应用细胞凋亡研究BIORAD脉冲场电泳介绍第43页研究表明:凋亡细胞DNA降解呈分步进行,首先是核小体之间裂解,产生50300 kb大小大片段(HMW),随即HMW片段深入分解成规则约18020