转发实验室常用技术method

1、2007-10-03|软琼脂集落形成率实验(软琼脂克隆1.2琼脂糖与2细胞培养1:1 的体2007-10-03|软琼脂集落形成率实验(软琼脂克隆1.2琼脂糖与2细胞培养1:1 的体积比混0.6的底层琼脂，6孔板中每个孔1.4ml温室凝固，取对数期细胞胰酶消化后吹散成单个细胞悬液，计数，并调细胞浓度为 10000 /ml，将 0.6琼脂糖与2细胞培养基以1:1 的体积比混合0.3的上层琼脂1ml 上层琼脂和100ul 单细胞悬（1000cell/well)，混匀，室温凝固。置于 37，5CO2 的细胞 率图像2007-10-03|MTT细胞以每孔3000 个接种至96 孔板，分成不同组，每组3

2、孔，利用10DMEM 培养液培养24 h 之后，向培养液中加一定工作浓度的药物（单体或混合物），继续培养 24 h 或 48h结束，直接向每孔5mg/ml MTT 10l，孵育24 小时（应在显微镜下观察）。去除培养液，每孔加入 DMSO 100l，充分振3 分钟，立即在酶标仪上测定 490nm 的吸光度值由于这种方法基于琥珀酸脱氢酶的活性，因而加入 MTT 之后应该在微镜下观察，药物是否可以改变细胞琥珀酸脱氢酶的活性。若是改变不可以使用此种方法另有根据细胞 ATP 含量测定细胞增殖的方法，但是都要考虑药物对ATP 是否另有根据细胞 ATP 含量测定细胞增殖的方法，但是都要考虑药物对ATP 是

3、否有影响所以测定细胞增殖，最简单，最原始，最麻烦的方法，进行细胞计数们感觉还是最好的方 2 5， 细胞培养液参照。96/241 细胞，可以将细胞调至浓度十万，之后利用排枪，吸取96/241 细胞，可以将细胞调至浓度十万，之后利用排枪，吸取 100ul，至 96 孔板中3， 241ml190%FBS，10%DMSO的冻存液，DMSO 加入 1ml 细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称/冷冻日期/操作 1.25 0.005 0.0630.123 30.003 0.0670.128 50.006 0.0650.120 8533胞数/ml4大格细胞总数/41000020-50l。 具体实验步骤如下：

4、利用RIPA细胞裂解液，提取经处理细胞的总蛋白，根据RIPA30min45l10倍之后，利用BCA利用BCA100 蛋白质定量测定试剂盒（购自 璃放置在制胶架上，根据上述PAGE璃放置在制胶架上，根据上述PAGE胶的配置方法配制分离胶，之后将配制胶灌于两个玻璃之0.5cm 1.5cm 处标记(胶会收缩)1cm，置PH8.8）未聚合的丙烯酰胺，滤纸（普通）吸干（带手套，Whatman3mm滤纸）。加样（冰上4mM 6mM 样品量06546B, 将上述加好的样品放于酶标板 C3730min D，取出酶标板，利用酶标仪测定其OD570 50l-950l50l-950l （预染蛋白质marker）色，

5、室温2.5h。之后快速利用washbuffer洗涤一次15min,再洗两次各5min首先按要求将一抗利用PBSTTBSTPVDF4冰箱过夜；之后浸于Washbuffer，按照4ml/cm2室温洗涤15minWash buffer25min 洗涤。将二抗按照要求进行稀释于PBST或TBST将kit 中的solution1 和solution2 等体积混和，之后按照 0.125/cm2 等体积覆盖于膜上（ 软琼脂克隆法鼠软琼脂克隆法鼠体内接种法检测细胞致瘤性的比将膜蛋白面向上，放于XrayFilmcassette,在暗室中将film放于膜上，盖上分钟。快速冲洗,之后放于第二个film，放置 10min.将冲洗的胶片放于室温凉干2007-09-29|PCRPCR现在已经是一种常规的生物学实验技术 ，俺也有相当一段时间采用这种技术来分析 的表达。现将此技术与大家 。PCRPCR一样，只是此技术的PCR 最大的麻烦是特异性和污染问题。首先采用别人 的引物为佳。当然采用的p r的级别要高点为好，例如PNAS以上等