体细胞胚发生

1、体细胞胚发生1.3.2 植物体细胞胚的发生愈伤组织 体细胞胚 植株1.3.2 体细胞胚胎发生细胞培养再生完整的植株茎芽分化（器官分化）体细胞胚胎发生受精卵并非完成胚胎发育的必要因素。 在组织培养中，起源于一个非合资细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程形成具有双极性的胚状结构，叫胚状体或体细胞胚。胚状体的特点：（1）、它不同于合子胚，因为它不是两性细胞 融合的产物；（2）、它不同于孤雌胚或孤雄胚，因为它不是 无融合生殖的产物；（3）、它不同于组织培养中通过器官发生途径 形成的茎芽和根，因为它的形成须经历 与合子胚相似的发育过程，而且成熟的 胚状体是一个双极性结构。一、体细胞胚胎发生的例证：1、无论补

2、加IAA与否，在含有椰子汁（10%） 的培养基上，石龙芮花器官个部分（包括 花药）以及体细胞组织都能增殖形成愈伤 组织。2、在博落回中，在一定的激素浓度下，能形 成体细胞胚。3、柑桔属植物是天然多胚现象（每个种子有一个以上的胚）的一个典型的例子。二、 体细胞胚胎发生的方式1、从培养中的器官、组织、细胞或原生质体 直接分化成胚，中间不经过愈伤组织阶段。 如石龙芮再生植株表面长出不定胚。2、外植体先愈伤化，然后由愈伤组织细胞分化 成胚。如博落回叶肉和柑橘珠心愈伤组织。外植体的成苗途径试管苗外植体愈伤组织根、芽芽根根 芽体细胞胚试管苗体细胞胚试管苗三、 影响体细胞胚胎发生的因子1生长调节物质 愈伤组

3、织的建立和增殖所需要的是一种含有生长素的培养基，通常所用的培养基是2，4D，浓度范围。在此能使胚性细胞团数量不断增加，但不出现成熟的胚。如果把胚性细胞团转移到一种生长素含量很低（或完全没有生长素的培养基，它们就能发育为成熟的胚。2 氮源 除生长素外，培养基中氮源的形态也会影响离体条件下的胚胎发生。只有当培养基中含有一定量的还原态氮时，才能出现胚胎发生过程。 在以KNO3为唯一氮源的培养基上建立起来的 愈伤组织，去掉生长素后不能形成胚。然而，若在 55mmol/LKNO3的培养基中加入少量的 (5mmol/L)NH4Cl形态的氮，胚胎发生过程就会出现。 还原态氮和氮化态氮最适合的比是10mmol

4、/LNH4Cl和40mmol/LKNO3 欲使胡萝卜培养细胞形成体细胞胚，必须有一个最低数量的内源NH4存在（每千克鲜重的组织约5 mmol/L）。如果内源NH4达不到这个临界值，细胞就不能进行胚胎分化。而要使细胞内NH4达到这个水平，不但需要很少量的外源NH4存在（），还需要供应相对浓度很高的NO3-(60mmol/L).3 其他因子1、高浓度的钾（20 mmol/L ）是胚胎发生所必 需的。2、在培养基中溶解氮的含量应低于一个临界值 （），否则将有利于生根，而不利 于成胚。3、在培养基中加入活性炭也能提高胡萝卜细胞 发生的频率。4、如果外加与枸橼胚珠所产生的浓度相当的乙 醇，能显著抑制胡萝

5、卜培养物的胚胎发生， 而非挥发性的物质如IAA、ABA、GA 也能 抑制其胚胎发生。四、 体细胞胚胎发生的解剖学和细胞学 在胡萝卜悬浮培养中，可以看到大量球形胚自由地飘浮在培养液中，说明胚是起源于单个细胞。但在对胡萝卜和石龙芮离体条件下体细胞胚胎发生的详细研究表明，虽然胚是单细胞起源的，但在诱导期和胚胎发生早期，这些细胞与相邻细胞之间仍然保持着胞质联系。胞间联系的脱离只发的多细胞时期。 在胡萝卜悬浮培养中，对愈伤组织形成和生长的解剖学和组织学研究表明，在培养中存在两种类型的细胞：、自由分散在培养基中的大而高度液泡化的 细胞，一般不具胚胎发生能力；、成簇成团存在的体积小而细胞质致密的细 胞，具成

6、胚能力。 能够成胚的细胞团可称为胚性细胞团。 在含有生长素的培养基中，胚性细胞团虽不能发育为成熟的胚，但它本身可通过细胞的增殖和细胞团破碎不断延续。 胚性细胞团在破碎之前包含两种不同类型的细胞。 处在中央的那些细胞具有一个单个大液泡，小而致密的核。 在胚性细胞团的外围，则是成群的非常活跃的分生细胞。 由于中央细胞体积增大，彼此分离，可引起胚性细胞团解体。 然而，若把聚成小团的分生细胞或新形成的胚性细胞团筛选出来，转移到不含生长素的培养基上，在它们的外层就会形成很多体细胞胚。体细胞胚的成熟过程 体细胞胚常常在原来的培养基上成熟和萌发。但有的物种幼龄或成熟的胚必须先经历一段低温之后才能正常地长成小

7、植株。体细胞胚与合子胚的比较 体细胞胚与合子胚早期的分裂顺序不完全相同。即使是合子胚本身，它们的早期胚胎发育过程也常常偏离正常的方式。 但不论早期的胚胎发育途径如何，合子胚和不定胚一般都能发育成正常的成熟胚。与合子胚相似，球形期后的体细胞胚呈现一种固定的极性，根据指向愈伤组织或胚性细胞的中央，茎芽极朝外。与合子胚相比，成熟体细胞的进一步发育过程及形态特征也是相当正常的。 与合子胚不同的是，在培养中形成的体细胞胚常常具有两个以上的子叶。若在培养基里加入0.1-1.0 的umol/L的ABA,则可抑制体细胞胚的异常增殖,阻止沿下胚轴长出不定胚以及形成大量异常子叶的现象，并可避免早熟萌发，从而使体细

8、胞胚能够正常发育。1.3.4 影响植物离体形态发生的因素1.3.4.1 植物种类和基因型植物物种和品种基因型影响愈伤组织的分化 程林梅等（2001）的研究表明，利用不同基因型大豆品种的下胚轴作外植体进行组培时，培养基对愈伤组织的影响不明显；细胞分裂素（KT）和NAA的配比浓度对其愈伤组织的分化影响显著；不同基因型大豆植株再生作用差异明显；外植体取材时间和取材部位对再生植株的形成也具有较大的影响，再生能力最强的取材部位时从子叶节到下胚轴6mm区段,当下胚轴长到23cm时取材最佳。不同基因型、激素浓度对大豆植株再生的影响*资料来源:基因型和激素浓度对大豆植株再生的影响.程林梅等，植物学通报2001

9、 .18(3):367-370.木本植物愈伤组织形态发生的人为调控 第一步：利用分化培养基（含有6-BA、CPPU、KT）使愈伤组织形成不定芽，增加繁殖系数。 第二步：当不定芽长大出现叶片后，再将伸长的苗从基部切下转入含生长素类（如IAA、NAA）的生根培养基上培养诱导根的生成。 芦荟愈伤组织形态发生的人为调控 1、先用MS培养附加不同浓度的6BA，促进不定芽的生成。 不同浓度6-BA对库拉索芦荟增殖的影响芦荟愈伤组织形态发生的人为调控2、然后将抽枝的小植株转移到MS附加不同浓度NAA培养基上培养，诱导根的发生与生长 。 不同浓度NAA对库拉索芦荟生根的影响1.3.4.2 培养材料的生理状态(

10、1)植株的发育年龄： 一般情况下，幼态组织比老态组织具有较高的形态发生能力，特别是生根能力。 (2)培养器官或组织类型： 同一植物的不同器官、组织或细胞，其形态发生的能力和方式常有所不同。如种子、幼胚和下胚轴较容易形成胚状体，而茎段、叶片则比较困难。 (3)培养时间和细胞倍性 愈伤组织培养时间过长或继代次数太多，往往会推迟或降低形态发生的能力，所以一般均取处于旺盛生长期的愈伤组织材料来诱导器官的形成。 1.3.4.3 培养基 一、 影响体细胞胚胎发生的因子1、生长调节物质 愈伤组织的建立和增殖所需要的是一种含有生长素的培养基，通常所用的培养基是2，4D，浓度范围。在此能使胚性细胞团数量不断增加

11、，但不出现成熟的胚。如果把胚性细胞团转移到一种生长素含量很低（或完全没有生长素的培养基，它们就能发育为成熟的胚。2 氮源 除生长素外，培养基中氮源的形态也会影响离体条件下的胚胎发生。只有当培养基中含有一定量的还原态氮时，才能出现胚胎发生过程。 在以KNO3为唯一氮源的培养基上建立起来的 愈伤组织，去掉生长素后不能形成胚。然而，若在 55mmol/LKNO3的培养基中加入少量的 (5mmol/L)NH4Cl形态的氮，胚胎发生过程就会出现。 还原态氮和氮化态氮最适合的比是10mmol/LNH4Cl和40mmol/LKNO3 欲使胡萝卜培养细胞形成体细胞胚，必须有一个最低数量的内源NH4存在（每千克

12、鲜重的组织约5 mmol/L）。如果内源NH4达不到这个临界值，细胞就不能进行胚胎分化。而要使细胞内NH4达到这个水平，不但需要很少量的外源NH4存在（），还需要供应相对浓度很高的NO3-(60mmol/L).3 其他因子1、高浓度的钾（20 mmol/L ）是胚胎发生所必 需的。2、在培养基中溶解氮的含量应低于一个临界值 （），否则将有利于生根，而不利 于成胚。3、在培养基中加入活性炭也能提高胡萝卜细胞 发生的频率。4、如果外加与枸橼胚珠所产生的浓度相当的乙 醇，能显著抑制胡萝卜培养物的胚胎发生， 而非挥发性的物质如IAA、ABA、GA 也能 抑制其胚胎发生。二、激素对愈伤组织分化的影响 植

13、物生长调节物质在分化过程中的作用是极为明显的，合适的植物生长物质配比在器官分化中起着重要的作用。 如仙人掌科的金牛掌茎段培养中，当6-BA的浓度是NAA的50100倍时，茎段的愈伤组织可以再分化出仔球，而6-BA浓度过高(150倍)或过低(10倍)则无仔球形成。 愈伤分化不同浓度的激素对烟草愈伤组织的影响器官分化的植物激素控制理论大量的实验结果表明： 大多数植物组织或器官的再生作用符合器官分化的植物激素控制理论。 即：生长素与细胞分裂素的比例小时则产生苗，比例大时则生根，而两种激素的比例适中时，则产生无结构的愈伤组织。外植体愈伤组织芽根再生植株脱分化再分化高生长素(1,2-D)高(生长素/细胞

14、分裂素)低(生长素/细胞分裂素)器官发生途径影响愈伤组织分化的其他因素1）、生长素对维管组织分化过程有显著影响. 法国植物学家Camus（1949）最早将小营养芽嫁接在一种菊苣属植物根的愈伤组织（由薄壁细胞构成）表面，营养芽经培养一段时间后分化出维管组织。 Wetmore等许多人的研究也证实芽之所以能诱导愈伤组织分化是因为它在生长时合成了某些植物激素。 一般说来生长素浓度和木质部发生之间存在着一种反比关系，低浓度的生长素能刺激木质部的发生。生长素对维管组织分化所起的作用在很大程度上取决于糖的存在。在洋丁香愈伤组织培养时，如果灌注到愈伤组织顶面缺口里的琼脂含有的IAA和1%的蔗糖，愈伤组织只能形

15、成很少的木质部分子。若保持生长素浓度不变，而将蔗糖水平增加到2%，则有利于木质部的分化，但韧皮部很少。 当蔗糖增至2.5%3.5%时，木质部与韧皮部都可以分化形成，而当蔗糖增至4%时，只有韧皮部的分化。影响愈伤组织分化的其他因素2） 细胞分裂素能刺激大豆子叶愈伤组织木质部的分化。3） IAA与激动素之间能协同影响烟草愈伤组织木质部的分化形成。生长素与赤霉素对植物愈伤组织的分化形成也存在着协同作用。乙烯也参与木质部的形成，有人研究发现缺乏乙烯的番茄突变体植株木质部内没有导管，但正常植株是具有导管的。4） 硝酸银能抑制大豆愈伤组织木质部的分化，加入蛋氨酸可以克服硝酸银的抑制作用。、培养条件光照：愈

16、伤组织的诱导需弱光或不需光，分化需光。继代培养一般需光。此时光对器官的作用是一种诱导反应。温度：一般采用2428的恒温条件进行。湿度：较大，以免引起培养基干缩。 141 基因表达与位置效应 基因表达(geneexpression)指储存遗传信息的基因经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过程。 位置效应1.4.2 器官分化信息传递 1.4.2.1 胞外信号分子 胞外通讯信号分子又称第一信使(first messenger)。在植物细胞外的通讯信号分子，如植物激素主要通过维管束系统在细胞与器官间进行调节。它在植株的某些发育阶段，于特，部位发生作用。植物激素信号由位于膜或其它部位的受体所接收，进一步

17、直接或间接地影响：因表达。当植物激素以直接的形式影响基因表达时，就会产生在转录、翻译等水平上的不同，应，从而控制酶的合成，影响代谢变化，最终产生某些生理反应。 胞内信号分子 胞内通讯信号分子又称第二信使(secondmessenger)o在植物体内，它们主要通过钙，号系统、磷酸肌醇信号系统等发挥作用，其中磷酸肌醇信号系统是以磷酸肌醇代谢为基础进：信号转移的。 5.10 细胞全能性的实际应用5.10.1 概说 只有体细胞的全能性，体细胞能够产生完整的植株，才有可能通过细胞水平上的操作（体细胞杂交、离体单细胞的突变等）进行农作物的改良。 目前，在具有多胚性柑橘品种中，珠心细胞成胚是建立无病毒无性系

18、的唯一可行的天然途径。5.10.2 人工种子 人工种子 人工种子是指通过植物组织培养技术获得有胚芽、胚根、胚轴等结构的植物胚状体，并且用适当方法将胚状体包裹起来，用以代替天然种子进行繁殖的一种结构。人工种子的概念是1978年在加拿大举行的第四届国际植物组织、细胞培养会议上首次提出来的。目前研制的人工种子，是由胚状体、作为保护性外壳的人工种皮和提供发育所需营养的人工胚乳三部分组成的。 人工种子有许多优点。首先，它解决了有些作物品种繁殖能力差、结子困难或发芽率低 等问题。第二，人工种子可以工业化生产，提高农业的自动化程度。第三，人工胚乳中除含有胚状体发育所需的营养物质外，还可以添加各种附加成分，如固氮细菌、防病虫农药、除草剂和植物激素类似物等，有利于幼苗茁壮成长，提高作物产量。第四，用人工种子播种可以节约粮食。例如，一个12 L的发酵罐在20 d内生产的胡萝卜胚状体，可以制成1 000万粒人工种子，满足几千公顷农田的