人民医院基因扩增实验室肺炎支原体核酸定量检测标准操作程序

1、人民医院基因扩增实验室肺炎支原体核酸定量检测标准操作程序项目名称肺炎支原体核酸定量检测检验方法名称T叫Man荧光定量检测方法学原理用一对肺炎支原体特异性引物和一条肺炎支原体特异性荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团(R)和一个荧光淬灭基团(Q)。探针完整时，R基团发射的荧光信号被Q基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使R荧光基团和Q荧光基团分离，Q基团对R基团的抑制吸收作用消失，荧光监测系统就可接收到R基团的荧光信号。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成。被切割产生的荧光分子数与PCR产物的数量成比例，这样就实现了荧光信号的累积与PCR产

2、物形成完全同步。因此根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。标本要求适用标本类型：痰液、咽拭子等。标本采集（泌尿生殖道分泌物）a）痰液使用一次性吸痰器，患儿取仰头平卧位，将吸痰管缓缓插入咽喉部，调节负压，将气管深部分泌物（在雾化吸入后效果较好）缓缓吸入储液瓶中，反复数次，储液瓶中分泌物即为标本，密封送检。a）咽拭子用咽拭子取咽部分泌物（多数会有粘稠的痰液），将咽拭子置入无菌玻璃管，密封送检。标本保存：标本可立即用于测试，也可以保存于-20待测，保存期为6个月。试剂名称：肺炎支原体核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）生产厂家：中山大学达安基因股份有限公司；试剂货号：#DA-B06

3、4；包装规格：20人份/盒；试剂成份：组成部分数量DNA提取液（5001/管）2管MPPCR反应液（400/管）2管T叫酶（60皿管）1管MP阴性质控品（50皿管）1管组成部分数量MP强阳性质控品（50皿管）1管MP弱阳性质控品（50皿管）1管MP阳性定量参考品（1.0义105基因拷贝/ml）10皿管1管MP阳性定量参考品（1.0义106基因拷贝/ml）10皿管1管MP阳性定量参考品（1.0义107基因拷贝/ml）10皿管1管MP阳性定量参考品（1.0义108基因拷贝/ml）10皿管1管5.6试剂储存条件：保存于20，有效期6个月。仪器ABI7500全自动基因扩增检测仪操作步骤DNA提取阴性质

4、控品处理a）向阴性质控品管中加入等量DNA提取液充分混匀，100恒温处理101分钟；b）12000r/min离心5min,备用。标本处理痰液a）痰液中加入4倍体积的生理盐水，用1ml的枪头反复吹打后置4冰箱过夜，使痰液充分液化；b）用枪头或吸管混匀后吸取1ml至1.5ml离心管中，12,000rpm离心5分钟；c）去上清，沉淀中加入mDNA提取液充分混匀，100恒温处理101分钟；d）12,000rpm离心5分钟，备用。咽拭子a）向玻璃管中加入1.5ml灭菌生理盐水，充分震荡摇匀，挤干棉拭子，立即离心；或置4冰箱过夜；b）12,000rpm离心5分钟，沉淀加灭菌生理盐水1ml混匀，12,000

5、rpm离心5分钟；以下步骤同7.1.2.1步骤c、doMP弱阳性质控品处理（同阴性质控品）；MP强阳性质控品处理（同阴性质控品）；MP阳性定量参考品处理：8000rpm离心数秒，备用；PCR扩增试剂准备（在试剂准备区操作）：按比例（MPPCR反应液401/人份+T叫酶31/人份）取相应量的PCR反应液及Taq酶，充分混匀后按43皿管分装至0.2ml离心管中备用。加口样：向准备好试剂的0.2ml离心管中，分别加入处理后的样品（包括样本、阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质控品）上清液2可，或直接加入阳性定量参考品2可，8000rpm离心数秒，放入仪器样品槽。设置PCR循环扩增程序如下932分钟预

6、变性；9345秒5560秒10个循环9330秒5545秒30个循环阴性结果判定：如果增长曲线不呈S型或Ct值=30,则实验结果判为样品的UUDNA总含量小于检测极限。阳性结果判定：如果增长曲线呈S型曲线且Ct值30,则：a）若样品的QtyW1X108,则痰液标本的MPDNA含量二Qty/4基因拷贝/ml,咽拭子标本的MPDNA含量二Qty/20基因拷贝/ml;b）若实验结果，样品的Qty1X108,则痰液标本的MPDNA含量为2.5义107基因拷贝/ml,咽拭子标本的MPDNA含量5X106基因拷贝/ml。如果需要精确定量结果，可将提取后的样品稀释100倍再检测。c）若样品的Qty1X104,

7、则痰液标本的MPDNA含量2.5X103基因拷贝/ml,咽拭子标本的MPDNA含量500基因拷贝/ml;质控a）阴性质控品：全部阴性;b）阳性质控品：全部阳性,且强阳性质控品检测值允许范围在2.5X106基因拷贝/ml4.0X107基因拷贝/ml范围，弱阳性质控品定量参考值在2.5X104基因拷贝/ml4.0X105基因拷贝/ml范围；（参考值为仪器自动分析计算出的数值）；c）阳性定量参考品：均为阳性，且线性相关系数0.97W|rW1；d）以上要求需在同一次实验中同时满足,否则,本次实验无效,需重新进行。0参考范围低于检测下限1性能指标灵敏度：1.0X104基因拷贝/ml线性范围：1.0X10

8、4基因拷贝/ml1.0X108基因拷贝/ml临床意义肺炎支原体是呼吸道感染较常见的致病菌，近几年有增加趋势，感染后除引起以往认为的非典型肺炎外，还可引起肺外各系统改变，且有死亡病例报道。采用PCR方法检测肺炎支原体DNA,可早期、快速、准确、敏感地诊断肺炎支原体感染。注意事项实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范，实验人员必须进行专业培训，实验过程严格分区进行（试剂准备区、标本制备区、扩增和产物分析区），所用消耗品应灭菌后一次性使用，实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不能交叉使用；为试剂和标本制备阶段提供生物安全柜，实验过程中穿工作服，带一次性手套，使用自卸管移液器；对每次实验进行质量控制；试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融；自备灭菌生理盐水；标本处理时“去上清”步骤，注意吸头不要碰触沉淀；试剂盒DNA提取液内含不溶于水的物质，取样时需用加样器充分混匀后吸取。如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样后堵塞吸头现象，可先用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪去一截；标本制备区所用过的吸头请打入盛有消毒剂的容器，并与废弃物一起灭菌后方可丢弃；实验完毕用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；所有检测样品应视为具有传染性物质，操作和处理均需符合相关法规要求：卫生部微生物生物医学实验室生物安全通用准则和医疗废物管理条例。中华人民共