蘑菇酱油的细菌群落及挥发性风味特征

1、蘑菇酱油的细菌群落及挥发性风味特征传统酱油以大豆或豆粕为底物在米曲霉的作用下经制曲和盐水发酵两个阶段自然发酵而成。但发酵底物局限性限制了酱油品质的提升。近年来，作为氮源或碳源的酵母抽提物、玉米浆、植物茎叶以及无机盐通常被添加到发酵的底物中以提高种曲和自然发酵菌群的活性，达到改善酱油发酵微生态并促进特征风味形成的目的1。而蘑菇本身是一种富含氨基酸、多糖、碳水化合物、粗纤维、核苷酸、维生素、脂肪酸和酰胺类物质的保健食材，将其应用到酱油的发酵中可以提高酱油的品质并满足消费者的健康需求。之前研究发现，猴头菇可以促进酱油中的优势菌群从Stenotrophomonas向Bacillus转换，并且酯类、醇类

2、和亚油酸类香气成分被上调2。杏鲍菇酱油以杏鲍菇面粉为53的质量比例发酵时，酱油颜色红亮，并且菇香浓郁3。但不同种类蘑菇酱油的风味特征和关键香气成分的代谢菌群溯源未被探究。酱油发酵时菌群微生态的特点将直接影响酱油风味的产生。Bacillus通常具有淀粉酶、蛋白酶和L-谷氨酰胺酶基因，这可以实现发酵底物向风味组分的转变。Bacillussubtilis是酱油中4-乙基愈创木酚(辛香、香荚兰香)和麦芽酚(焦奶油香)的主要贡献者4。Bacillusvelezensis则有助于3-甲基丁醛(苹果香)的生成5。此外，Staphylococcus是驱动酱油发酵的优势菌属之一，其具有产生L-谷氨酰胺酶和2-甲

3、基丙醛(甜香)的能力6。同样的，乳酸菌也是酱油发酵中的核心菌群。Weissella和Pediococcusacidilactici与酱油乳酸和乙酸等有机酸的产生密切相关；Lactobacillusplantarum可以提升酱油酮类和酚类物质的含量；Tetragenococcushalophilus则是醛类和酸类风味的优质贡献者7。因此，对蘑菇酱油发酵的微生态进行表征有利于风味组分的溯源和特征风味酱油的开发。该研究首先以宏观的微生物多样性分析和微观的共发生模型探讨了蘑菇酱油发酵的微生态特点，并挖掘了核心发酵菌群。随后以GC-MS技术表征了各种蘑菇酱油的风味特征。并且将核心发酵菌群和特征香气组分进

4、行了双因素正交偏最小二乘法(the two way orthogonal partial least squares, O2PLS)建模以探究二者的相关性。该研究为酱油的改进和新型蘑菇酱油的商品化提供了依据。1 材料与方法1.1 试剂大豆、炒小麦粉，湖北安琪酵母股份有限公司；猴头菇、滑子菇、草菇、双孢菇、杏鲍菇、姬松茸、鸡腿菇、茶树菇、香菇，哈尔滨北大荒商贸集团控股公司；米曲霉As3.042，天津科技大学菌种室；16S rRNA的V3V4引物、TruSeqDNA PCR-Free Sample Preparation Kit，北京诺禾致源科技股份有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，贵州天根生

5、物有限公司；C6C33正构烷烃混合物标准品(97%)，美国Sigma-Aldrich公司。1.2 仪器与设备Illumina NovaSeq 6000高通量测序仪，上海鲸舟基因科技有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；7890AGC气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦科技公司；Rtx-5色谱柱，上海圣宾仪器科技有限公司；手动顶空固相微萃取进样器、固定搭载装置及固相微萃取头(50/30 m DVB/CAR)，美国Supelco公司。1.3 实验方法1.3.1 蘑菇酱油的发酵将浸泡6 h的120 g大豆与120 g炒小麦粉和26.7 g鲜蘑菇粉混匀浸润，121

6、、0.1 MPa灭菌20 min。冷却至35 后，接入质量比0.3%的种曲，混匀后于30 恒温培养箱培养。大曲出现白色菌丝时进行第一次翻曲，表面呈淡黄色时第二次翻曲，培养至大曲黄绿色时收曲。向成熟的大曲拌入曲料质量2倍的180 g/L的盐水，装入发酵罐进行升温式开放发酵。初始发酵温度16 ，每天升高1 ，升温至30 时进入恒温发酵阶段，发酵周期为180 d，并每天进行搅拌2。以传统大豆酱油作为对照组，将浸泡6 h的140 g大豆与120 g炒小麦粉搅拌均匀，发酵流程同实验组。从发酵起始每隔30 d取样1次，并对所有发酵阶段样品混样处理，实验组、对照组每组样品取3个平行备用。1.3.2 蘑菇的营

7、养成分测定水分测定参照GB 5009.32022食品中水分的测定；总灰分测定参照GB 5009.42022食品中灰分的测定；粗蛋白测定参照GB 5009.52022 食品中蛋白质的测定；粗脂肪测定参照GB 5009.62022食品中脂肪的测定；粗纤维测定参照GB/T 5009.102022植物类食品中粗纤维的测定；氨基酸测定参照GB/T 5009.1242022食品中氨基酸的测定。1.3.3 细菌群落高通量测序使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取发酵酱油细菌DNA，以质控和稀释后的总的酱油细菌菌群DNA为模板(1 ng/L)，扩增16S rRNA的V3V4区域。其引物为338F(5-ACTCCT

8、ACGGGAGGCAGCAG-3)和806R(5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3)。PCR反应体系(50 L)：10buffer 5 L，三磷酸脱氧核糖核苷1 L，上游引物(10 mol/L)1 L，下游引物(10 mol/L)1 L，TaqDNA聚合酶(50 U/L)0.5 L，DNA模板100 ng，超纯水40 L。PCR扩增条件为：95 ，5 min；95 ，30 s；60 ，30 s，28个循环；72 ，90 s；72 ，10 min。将PCR产物以2%的琼脂糖凝胶电泳进行混样和纯化。回收的产物以TruSeqDNA PCR-Free Sample Preparation

9、Kit试剂盒构建文库，并使用NovaSeq 6000进行上机测序。1.3.4 生物信息学分析将下机数据截去标记条带和引物后，对得到的reads进行拼接。将得到的原始数据进行过滤和质控得到最终有效序列。以97%的一致性将有效序列聚类成可操作分类单元(operational taxonomic units, OTU)，并进行物种解释。以MUSCLE软件(版本3.8.31)进行多序列比对并确立系统发生关系。将均一化的样本数据以Qiime软件(版本1.9.1)计算香农和Chao1指数，并计算weight Unifrac距离和构建UPGMA样本聚类树。主坐标分析(principal coordinate

10、 analysis, PCoA)使用R(版本3.6.3)软件的WGCNA、stats和ggplot2软件包。PCoA图中3个相同的点代表3个平行，PC1和PC2分别是2个解释度最高的主成分，样品间的距离表示细菌群落的差异。线性判别分析得分设置为3.5，以筛选出样品组的生物标记选出相对丰度大于0.05 %的菌属为节点，计算Spearman相关性以过滤掉关联性较弱的节点(P0.7，P0.01)。以Gephi-0.9.2软件重构生态共发生网络，其中重构网络中的节点为关联性较高的菌属，连接节点的边对应节点之间的相关性，随后计算了网络的聚类系数。1.3.5 挥发性成分检测固相微萃取条件：选用50/30

11、m DVB/CAR萃取头，在20 mL顶空瓶中加入4 mL发酵样品和1.5 g NaCl，60 预热20 min，插入萃取头，萃取吸附20 min，GC解吸5 min(250 )。色谱条件：色谱柱为Rtx-5色谱柱(30 m0.25 mm，0.25 m)。升温程序：35 保持4 min，以5 /min的速度升温至150 ，恒温保持4 min，然后以3 /min的速度升温至220 ，保持5 min。载气He，流速1.0 mL/min，不分流进样。质谱条件：EI离子源，电子能量70 eV，离子源温度230 ，质量扫描范围m/z35500 u。1.4 数据分析利用保留指数(retention ind

12、ex, RI)，并结合NIST14谱库检索进行定性分析。将C6C30正构烷烃混合物单独进样，进样量1 L，升温程序和GC-MS检测条件一致。保留指数计算如公式(1)所示：(1)式中：RI，保留指数；n，未知物流出前正构烷烃的碳原子数；t(n)，具有n个碳原子的正构烷烃调整保留时间，min；t(n+1)，具有n+1个碳原子的正构烷烃调整保留时间，min；t(i)，待测组分的调整保留时间，min。随后以峰面积比值法对挥发性成分进行定量8。显著性分析由SPSS 25执行。其中，香农和Chao1指数的显著性分析由单因素ANOVA检验执行，标注的不同的字母代表显著差异(P0.05)。挥发性成分的显著性分

13、析由Kruskal-Wallis秩和检验执行，并以FDR进行多重检验矫正。风味代谢物与微生物组之间的相关性由SIMCA-14.1构建的O2PLS模型表征。同时，以R软件(版本 3.6.3)计算了风味成分和核心菌群的Spearman相关性系数。2 结果与分析2.1 蘑菇的主要营养物质从表1可知，每种新鲜蘑菇的含水量都在90 g/100 g以上；总灰分含量最低的是双孢菇(8.12 g/100 g)，最高的是杏鲍菇(14.25 g/100 g)。新鲜蘑菇中蛋白质的含量占约3%，双孢菇含有最高量的粗蛋白，猴头菇和草菇其次，在植物中属于蛋白质含量比较高的食品。蘑菇作为低脂肪食品，其粗脂肪含量仅占1%左右

14、。蘑菇中供能的单糖、双糖、淀粉类糖含量少，但含有比例较高的功能性多糖和膳食纤维。多糖是蘑菇的重要功能性物质，具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖、抑菌等生理活性。猴头菇较高的多糖含量(4.21 g/100 g)可能更加利于发酵益生菌的利用。表1 蘑菇中的营养成分 单位：g/100 gTable 1 Nutrients in mushrooms注：以可食用部分计(下同)氨基酸是食物风味的主要来源，蘑菇蛋白质含量是植物性食品中比较高的。根据表2可以看出，呈鲜味的氨基酸占比在总氨基酸的30%以上。各个呈味氨基酸浓度均大于其对应阈值，对酱油鲜味有较高贡献。草菇和猴头菇鲜味氨基酸占比最高，丰富的鲜味氨基酸是酱油发

15、酵不可或缺的物质。表2 蘑菇中呈鲜味氨基酸的含量Table 2 Content of umami amino acids in mushrooms2.2 蘑菇酱油的宏观微生态分别以香农和Chao1指数表征蘑菇酱油的多样性和丰富度(图1-a)。与大豆酱油相比，猴头菇酱油中细菌的多样性和丰富度显著降低(P0.05)。因为猴头菇本身特有的cyathane型二萜类次级代谢产物，如猴头菇素C和猴头菇素P，具有强烈的抗菌活性9。与之相反的是，香菇酱油中细菌的多样性和丰富度显著高于对照(P0.05)。香菇所携带的原始菌群，有助于有机质的降解和菌丝的生长，这为其他细菌提供了营养活性物质10。其他蘑菇酱油的多样

16、性和丰富度与大豆酱油相比都出现了一定的变化(P0.05)。蘑菇的添加为酱油发酵提供了丰富的菌体蛋白和蘑菇多糖，这诱导蘑菇酱油和传统大豆酱油的菌群出现偏移。a-多样性差异；b-组成差异图1 蘑菇酱油细菌的多样性和组成差异Fig.1 Diversity and composition difference of bacteria in mushroom soy sauce细菌群落结构的主坐标分析验证了蘑菇酱油的菌群特点(图1-b)。与多样性和丰富度的分析结果一致，猴头菇酱油的细菌群落是与其它酱油分离的。基于猴头菇的抗菌性，可能形成了某一优势且单一的菌群，并主导了酱油的发酵。其次，草菇、茶树菇和姬松

17、茸酱油的发酵菌群各不相同，这是蘑菇酱油风味多样化的前提。而鸡腿菇、杏鲍菇、双孢菇和滑子菇酱油的细菌群落在主坐标PC1(68.02%)上与大豆酱油是相似的，这些蘑菇对细菌群落的干预性较低。香菇虽然显著提高了细菌的多样性和丰富度，但香菇酱油的菌群结构依旧与大豆酱油类似。这意味着香菇虽然促进了菌群的繁殖，但这些菌群并不是酱油的核心发酵菌群。2.3 蘑菇酱油的微观系统型如电子出版附件1所示，Firmicutes和Proteobacteria是蘑菇酱油的两大主导菌门，这与传统大豆酱油的检测结果是一致的，蘑菇添加并不会破坏酱油菌群的系统型11。滑子菇、双孢菇和杏鲍菇对酱油菌群的改良作用并不明显，它们和大豆

18、酱油一样都被Proteobacteria 占据了主导地位。Proteobacteria 被认为是生物胺合成基因的主要携带者，这可能会降低酱油的品质12。而这种现象在姬松茸、茶树菇、香菇和鸡腿菇酱油中得到了改善。这些酱油中出现了丰富的Euryarchaeota和Cyanobacteria。Euryarchaeota通常是具有嗜盐和嗜酸特性的高抗逆细菌并且具有潜在的挥发性烷烃生产能力13。此外，Cyanobacteria和乳酸菌的协同发酵为姬松茸酱油提供了降血脂和抗肥胖的保健功能14。酱油发酵主要的菌属Bacillus、Listeria、Lactobacillus、Lactococcus、Stap

19、hylococcus、Roseburia等，都属于Firmicutes菌门，是酱油发酵的风味细菌，即在酱油发酵过程中的次生细菌。乳酸菌可以分解代谢酱醪中的碳水化合物产生乳酸等有机酸，降低酱醪的pH值，不仅能够抑制致病菌的生长繁殖还可以为后期酵母菌生长创造有利环境。Staphylococcus是肉类发酵食品产生风味物质的主要风味细菌。Bacillus产生的蛋白酶和淀粉酶可以分解蛋白质和淀粉类物质。复杂化合物的分解是影响发酵食品的关键步骤。在系统型变化最显著的草菇和猴头菇酱油中，Firmicutes取代Proteobacteria成为了主导菌门，而Firmicutes的丰富性通常是高品质发酵食品的

20、必要条件15。菌群共发生网络展示了各系统型聚类中菌群的协作方式(见电子出版附件1)。草菇和猴头菇构成的细菌菌群聚类由Stenotrophomonas辅以Staphylococcus和Bacillus维系连通性。但属于Proteobacteria的各个菌属和Firmicutes的节点多为负相关，这表明草菇和猴头菇酱油中的Firmicutes，特别是Staphylococcus和Bacillus对致病菌Stenotrophomonas具有抑制作用。这和Proteobacteria的动态变化通常与Firmicutes呈负相关的结论一致16。大豆酱油与杏鲍菇、双孢菇、滑子菇酱油菌群构成的系统型聚类的聚

21、类系数最低(0.47)，远小于聚类(0.59)和聚类(0.86)。因此，聚类的菌属协作性较弱。这导致菌群稳态相对较差，并且酱油的发酵进程易被外界环境改变，且酱油品质可控性降低。姬松茸、茶树菇、香菇和鸡腿菇酱油中的优势菌属Stenotrophomonas、Staphylococcus、Faecalibacterium和Bacillus在聚类的连通度并不高。核心发酵菌可能在这些酱油的发酵中单独发挥作用，因而缺乏了对Stenotrophomonas和Staphylococcus中潜在致病菌的抑制作用。然而，聚类中多样的非优势菌属却连通成了独特的“小世界”形态17。这可能与酱油的特征风味的形成有关。2

22、.4 蘑菇酱油的细菌菌群核心的细菌发酵菌属如图2-a所示，除了猴头菇、草菇和鸡腿菇酱油，其他酱油都以Stenotrophomonas为主导菌属。这与Stenotrophomonas在共发生网络中受多重发酵菌群抑制的现象一致。Stenotrophomonas的-半乳糖苷酶可以分解大豆和蘑菇产品中的抗营养因子，从而提高机体对营养物质的吸收效率18。但是，Stenotrophomonas的赖氨酸脱羧酶可将赖氨酸转化为1,5-戊二胺，这可能会对酱油的感官评估和安全性产生负面影响。Staphylococcus是草菇和鸡腿菇酱油的优势菌群也是滑子菇酱油的生物标记之一。Staphylococcus分解葡萄糖

23、、麦芽糖和蔗糖并产酸，是酱油发酵的主要驱动者之一19。大多数Staphylococcus(Staphylococcusaureus除外)被认为对人类无害，基于其高抗渗透性，酱油发酵时盐溶液的添加不会抑制Staphylococcus的活性20。此外，Staphylococcus可以产生挥发性脂肪酸，促进酱油风味的形成20-21。Bacillus主导了猴头菇酱油的细菌群落。由于其对淀粉和蛋白质的高效酶解作用，Bacillus被认为是酱油发酵中必不可少的细菌群落22。Bacillus是淀粉酶，特别是-淀粉酶的优良生产者。通过水解淀粉分子链中的-1,4-葡糖苷键，-淀粉酶可以将淀粉转化为短链糊精，麦芽

24、糖和葡萄糖23-24。特别的，Macellibacteroides和Methanosaeta是香菇酱油的生物标记，并且它们是聚类中“小世界”结构的主要贡献者(见电子出版附件1)。据报道，Macellibacteroides可以协作Arcobacter、Acinetobacter、Petrimonas和Clostrium起到促游离脂肪酸释放的作用，这可能是“小世界”结构的潜在功能。此外，Methanosaeta可能是香菇酱油中挥发性烷烃成分的主要贡献者25。Sphingomonas是双孢菇酱油菌群的生物标记，其可以降解单环芳烃、联苯、取代芳香化合物及多环芳香烃，并且苯甲酸可以通过Sphingom

25、onas代谢生成乙醛和丙酮酸盐，这增加了双孢菇酱油的水果香气。a-核心菌属；b-生物标记图2 蘑菇酱油的核心菌属和生物标记Fig.2 Core bacteria and biomarkers of mushroom soy sauce2.5 蘑菇酱油的风味组分各种蘑菇酱油间浓度差异显著的风味成分如图3所示。与大豆酱油相比，蘑菇酱油主要上调了酯类和醇类香气组分。蘑菇酱油中的酯类物质，如苯乙酸乙酯、油酸乙酯、-戊基-丁内酯、棕榈酸甲酯、亚油酸甲酯和安息香酸乙酯普遍升高，因此蘑菇酱油具有更浓郁的果香和花香风味。特别的，只有双孢菇和杏鲍菇酱油检测到了亚麻酸乙酯(酯香)。而丰富的亚油酸乙酯为茶树菇提供了

26、酯香的同时，也赋予茶树菇酱油抗动脉粥样硬化的保健功能。而具有蜡香和奶油香气的十六碳酸乙酯是双孢菇和茶树菇酱油的特征风味成分。图3 蘑菇酱油的特征风味成分Fig.3 Characteristic flavor components of mushroom soy sauce对于醇类香气，2-甲基-1-丁醇、蘑菇醇和异丁醇是蘑菇酱油普遍上调的风味物质。而具有玫瑰花香的苯乙醇是蘑菇酱油上调最显著的风味成分，特别是在杏鲍菇酱油中。异戊醇具有苹果和白兰地的香气，这是草菇酱油的特征香气。2,3丁二醇和乙醇分别在滑子菇和香菇酱油中显著提升，这为酱油增添了醇香。特别是与大豆酱油相比，乙醇在香菇酱油中提高了31

27、.82倍。此外，蘑菇的添加对酮、醛、酸和吡嗪类特征风味物质形成的干预性较小。蘑菇酱油对具有风信子香气的苯乙醛和焦糖味的异戊醛的生成具有普遍的促进作用。有趣的是，添加蘑菇发酵将剥夺酱油中具有橙子香气的D-柠檬烯成分，这可能是因为微生物的发酵作用将烯烃类成分氧化成了酯类。2.6 核心细菌菌群对风味的贡献如电子出版附件2所示，O2PLS模型(R2=0.966，Q2=0.895)表征了核心细菌菌群和风味成分之间的相互作用。模型预测结果与菌群的系统型聚类分析一致，蘑菇酱油在横坐标R2X1上出现了3种风味酱油的聚类。而作为对照的传统大豆酱油则位于O2PLS模型的中心，因此与蘑菇酱油相比，大豆酱油是缺乏风味

28、特点的。杏鲍菇、双孢菇和滑子菇的风味特点主要由酯类成分贡献，包括9-十六碳烯酸乙酯、油酸乙酯、硬脂酸乙酯、安息香酸乙酯、-戊基-丁内酯、邻二甲苯酸二丁酯和9,12-十八碳二烯乙酯。而这些酯类被预测与酱油中生物标记Roseburia和Sphingomonas的代谢有关。茶树菇和姬松茸酱油虽然有着和鸡腿菇和香菇类酱油类似的菌群系统型，它们依旧被O2PLS模型的R2X2坐标分开。茶树菇和姬松茸的风味成分主要与Vibrio、Cyanobacteria和Psychrilyobacter的代谢相关，而这些细菌主要来自于发酵的外界环境。因此，茶树菇和姬松茸酱油形成的特征酸味成分2-甲基丁酸和异戊酸主要受环境

29、因素的调控。相反，具有相同系统型的鸡腿菇和香菇酱油则以包括棕榈酸异丁酯、棕榈酸异丙酯、辛酸乙酯和正己酸乙酯在内的酯类香气为主，因为Faecalibacterium对短链脂肪酸的消解具有促进作用，并且是系统型聚类互作网络的主要维系者。如电子出版附件1所示，Faecalibacterium通过与Lactobacillus、Enterococcus和Streptococcus等多种乳酸菌的直接或间接协作促进了鸡腿菇和香菇酱油酯类风味成分的形成。与其他蘑菇相比，系统型中草菇和猴头菇酱油的菌群与大豆酱油差异最显著，这直接导致了草菇和猴头菇酱油的独特的风味成分构成。丰富的酯类、醇类、醛酮类和芳香杂环类成分共同构成草菇和猴头菇的风味特征。这种现象一方面归因于优势发酵菌Staphylococcus和Bacteroides的发酵驱动作用，另一方面是因为非优势菌群Methanosaeta和Macellibacteroides通过与其他菌群的协同作用参与了发酵。Spearman相关性系数(| 0.7)被用于进一步发掘菌群对风味物质形成的驱动作用(电子出版附件2)。Staphylococcus主要促进了酯类和醇类成分的形成。这与Staphylococcus可以促进挥发性脂肪酸的生成并促进其酯化反应的进行的结论一致19-20。Enterobac