荨麻提取物对5α还原酶抑制活性的研究

1、荨麻提取物对5-复原酶抑制活性的研究【摘要】目的研究荨麻提取物中水溶性成分的5a-复原酶抑制活性。方法基于荧光测定的方法，建立一种5a-复原酶抑制剂体外模型，从大鼠前列腺组织中提取5-复原粗酶,与底物睾酮Teststerne以及供氢体复原型辅酶NADPH共同组成了一种微量反响体系。利用荧光测定仪检测NADPH的含量，以荧光的强弱来判断5a-复原酶的活性，以非那雄胺作为阳性对照。结果同对照组相比，反响体系中参加荨麻提取物后荧光值有显著升高。结论荨麻根的水溶性成分在体外可以抑制5a-复原酶的活性。【关键词】5-复原酶荨麻双氢睾酮前列腺增生Abstrat:bjetiveTstudythe5-redu

2、taseinhibitryativityftheaqueusnstituentsinUrtiafissaE.Pritzsetrat.ethdsThe5-redutaseinhibitrsdelinvitrinludedaini-reativesystehihaspsedf5-redutaseextratedfrtheprstatesfalerats,teststerne(asasubstrate)andNADPH(asahydrgensupplier).ThenentratinfNADPHaseasuredbytheflureseneexaininatin.Thespeifiityf5-red

3、utaseasjudgedithfinasterideasapsitiventrl.ResultsTheabsrbanefflureseneinthereativesystehihasaddediththeextratfUrtiafissaE.Pritzasrearkablyhigherthanthereferenegrup.nlusinTheUrtiafissaE.Pritzsaqueusextrataninhibittheativityfthe5-redutaseinvitr.Keyrds:5-redutase；UrtiafissaE.Pritz；Dihydrteststerne(DHT)

4、；BenigePrstatiHyperplasia(BPH)良性前列腺增生症(BPH)是中老年男性常见病与多发病，发病率在40岁时约为23%，至90岁时可达88%。在寻找其治疗药物过程中，甾体5-复原酶抑制剂已成为研究热点之一1。从构效关系看，5-复原酶是定位于靶细胞微粒体上的膜蛋白,依赖复原型辅酶II(NADPH)作为供氢体，该酶广泛存在于前列腺及其它组织和器官中，是睾酮转变为双氢睾酮的催化剂2，它不可逆地催化睾丸酮(T)转为生理活性更强的双氢睾丸酮(DHT)，DHT被认为是良性前列腺增生症(BPH)的主要病因,抑制该酶活性,减少DHT生成，已经成为BPH非手术治疗的主要途径3。我们前期的药

5、理实验说明，荨麻根的提取物对去势大鼠前列腺腹侧叶和背侧叶的增生具有显著的抑制作用4。为了进一步研究提取物抗前列腺增生的作用机理，本实验选取5-复原酶为作用靶点，利用荧光测定的方法，研究荨麻提取物是否有抑制5-复原酶的活性。首先建立酶催化反响体系，利用辅酶NADPH具有自发荧光特性NADPH本身有强烈荧光，当NADPH与复原酶和底物反响后，NADPH生成NADP+,荧光随之淬灭通过荧光检测仪测定NADPH的含量来考察5-复原酶的活性5。1材料与仪器1.1药品与试剂非那雄胺(保列治),erkSharpDhe(U.K.)Ltd。批号J20220221；睾酮，上海久邦化工公司产品，批号20221106

6、；NADPH，Bisharp公司产品，批号041939；其他化学试剂均为国产分析纯。1.2仪器荧光检测仪型号：FP-6500，Jas公司；台式高速冷冻离心机型号:Bifugeprie，RHeraeus公司；ALPHA1-4型冷冻枯燥机HRIST公司；数显恒温水浴锅型号：HH-2，常州国华电器公司。2方法2.1复原酶的制备6雄性SD大鼠3只体重(200g10)g大连医科大学实验动物中心提供，禁食不禁水过夜后处死，迅速取腹侧的前列腺组织在冰台上剪碎，用预冷的匀浆液(蔗糖0.73l/L，氯化钙1.91l/L)在玻璃匀浆器中匀浆7，在4下以10000r/in高速离心20in，取上清液再以16000r/

7、in低温高速离心30in，即为5-复原酶提取物，采用Lry法测定蛋白含量，以酶提取物中的总蛋白含量表示5-复原酶提取物的含量，将提取物放入小离心管在-70下保存，临用前取出。2.25-复原酶活性测定和反响条件优化取5.0l的小试管，将底物、酶提取液,辅酶等反响成分依次参加，然后参加缓冲液PBS2.0l/L,蔗糖0.2l/L,EDTANa21.0l/L,pH6.8至2l，在37下反响1h。然后用荧光检测仪测定反响体系的荧光值。为了获得最正确酶活性测定反响参数，对反响温度、底物、酶的浓度以及反响时间的反响条件进展优化，同时以特异性5-复原酶抑制剂非那雄胺8,9作为阳性对照。2.3荨麻提取物的制备和

8、活性研究取荨麻根50g，粉碎成1的小段，室温下用水浸泡12h，将提取液过滤浓缩后，加乙醇至浓度到达80去除小分子成分，防止荧光干扰，沉淀冷冻枯燥后配制成2g/l溶液，按照“2.2的操作向酶反响体系中参加(最终浓度0.1g/l)，酶促反响后测定其荧光值。3结果3.1辅酶浓度和荧光测定条件辅酶NADPH浓度为1l/L，荧光仪测定条件：激发波长340n；吸收波长461n；狭缝宽度3n；响应时间0.5s。3.2睾酮浓度对酶活性的影响在固定酶提物浓度1.2g/l和辅酶NADPH的浓度1l/L的条件下，逐步增加睾酮浓度，分别是：0.1，0.2，0.5，2.0，20.0l/L和200l/L，在37条件下反响

9、1h，测定荧光值。如图1所示，当底物浓度在00.5l/L时，随着睾酮浓度变大，荧光值降低，但当底物浓度增加10倍，100倍时，荧光值不再变化，说明当睾酮浓度到0.5l/L时，即可获得较高的酶活性。转贴于论文联盟.ll.3.3酶提取物浓度对酶活性的影响确定底物和NADPH浓度以后，考察反响体系所需的酶量，以总蛋白含量表示5-复原酶提取物含量，用缓冲溶液稀释成一系列浓度，浓度分别为：0.3，0.6，1.2，1.8，2.4g/l，在37条件下反响1h后测定荧光值。如图2所示，随着酶量的增加，荧光值不断降低，当粗酶浓度到达1.2g/l以后，荧光值趋于恒定，因此将反响的酶浓度定为1.2g/l。3.4反响

10、温度对酶活性的影响设置不同的温度值，考察对5-复原酶的影响，温度值分别是：15，25，37，45，60。如图3显示，在37条件下，相对荧光值最低，说明酶活性最高，当温度升高和降低时，活性有所下降，当温度升高到60以上时，荧光值到达较高，根本上已经失去活性，以37作为酶反响温度。3.5反响时间对酶活性的影响在固定酶的浓度和底物浓度的情况下，测定不同时间点荧光值的变化情况，时间点分别是：5，10，20，30，60，90，120in。如图4显示，随着反响时间的延长，荧光值逐渐下降，在反响60in以后，荧光值趋于恒定，说明酶已经反响完全，以60in作为反响时间。3.6阳性对照药对酶活性的影响向反响体系

11、中参加特异性复原非那雄胺，浓度依次为：10，25，50，75，100l/L。结果显示，非那雄胺呈浓度依赖性抑制酶促反响，浓度到达50l/L时，显示较强的抑制作用，说明采用荧光测定建立的5-复原酶活性测定方法具有专一性。3.7荨麻提取物的抑制活性酶促反响体系参加荨麻提取物(浓度为0.1g/l)，37下反响60in后，测定相对荧光吸收值，结果显示荧光相对值有显著升高，说明荨麻提取物具有5-复原酶抑制活性，抑制率到达了60.9%。4讨论在研究底物睾酮浓度对酶活性的影响时发现，当反响体系中不加睾酮时，荧光值也有所降低，可能有两个原因，一是大鼠组织液中本身就存在少量睾酮参加了5-复原酶反响，二是NADP

12、H是一种非特异性的复原型辅酶，它可能作为酶提取物中其它的复原酶的供氢体而在反响中消耗，因此荧光值降低。文献报道荨麻治疗前列腺增生的作用机理包括抑制芳香酶，抑制Na+-K+-ATP酶以及与性激素结合球蛋白(SHBG)结合等等，但关于其抑制5-复原酶活性的报道一直都没有，本研究首次发现荨麻的水溶性成分具有抑制5-复原酶的活性，至于是哪一个有效部位，多糖，蛋白质抑或其他极性成分还有待于进一步研究。【参考文献】1欧敏锐,戴小福,薛逢春,等.高效液相色谱法检测5-复原酶活性J.福州大学学报(自然科学版),2022,32(2):216.2张伦.5-复原酶抑制剂市场浅析J.西部药学，2022,3(5):27

13、2.3贾悦,王晓东,崔毓桂,等.5-复原酶在男性生殖中的作用J.生殖医学杂志，2022,12(2):115.4王永奇，冯宝民，李帆，等.荨麻属植物治疗BPH研究概况J.大连大学学报,2022,26(2):54.5孙祖越,郑维君,王晓麟,等.甾体5-复原酶活性的新测定方法J.中华内分泌代谢杂志,1998,14(3):206.6王炜,冀保全,唐玲,等.滇藏荨麻提取物的5-复原酶抑制活性的研究J.时珍国医国药，2022,19(9):2071.7Fvredrik.Gverge.AndrgenetablisinthePrstateftheFinasterideTreated,AdultRat:APssibleExplanatinfrtheDiffer