家兔血浆中龙胆苦苷浓度的高效液相色谱测定

1、家兔血浆中龙胆苦苷浓度的高效液相色谱测定【摘要】目的建立家兔血浆中龙胆苦苷的HPL检测方法,研究秦艽中龙胆苦苷在家兔体内的药代动力学规律。方法以秦艽水煎醇沉液家兔耳静脉注射后定时取血,色谱条件:SHI-PAKVP-DS色谱柱(1504.6,5);流动相:甲醇-乙腈-水51085;检测波长:271n;流速:1.0lin-1，测定血浆药物浓度，采用DAS软件计算药动血参数。结果龙胆苦苷血药浓度在0.683136.6gl-1范围内线性关系良好(r=0.9995),最低定量浓度为0.0342gl-1。日内、日间精细度均小于10,回收率为89.8101.4.3。药-时曲线符合三房室模型，主要药动学参数：

2、Tax=0.083h，ax=45.1gL-1，V=1.312Lkg-1，L=0.761Lh-1kg-1，t1/2=1.195h,AU(0)=30.78gL-1h-1。结论该方法具有准确、简便、快速的特点,可用于秦艽中龙胆苦苷的检测。【关键词】龙胆苦苷；高效液相色谱法；血药浓度；药动学秦艽作为一种常用的传统中药,野生品种早已不能满足临床需要，栽培秦艽开发利用尚处于起步阶段，对其的研究多见于化学成分及药效学方面，少有对药动学的研究。有报道龙胆苦苷在Beagle犬体内的药动学过程表现为静脉内给药一房室模型1;大鼠灌胃给予含龙胆苦苷药物后2；用HPL法测定龙胆苦苷呈静脉外给药的二房室模型。龙胆苦苷是裂

3、环烯醚萜苷类化合物，极性大，吸收较少，静脉外给药其血药浓度均较低。为此本实验选择兔耳静脉注射秦艽水煎醇沉液，用HPL法定量测定家兔体内龙胆苦苷的药动学过程。1材料与仪器1.1药品三年生栽培秦艽采于宁夏六盘山药材栽培基地(由宁夏六盘山药材栽培基地张守宗高级农艺师提供)，经宁夏药检所邢世瑞主任药师鉴定原植物为秦艽GentianaarphyllaPall.的生药材；按中药制剂药理学实验的常规制备方法制备秦艽水煎醇沉液1.0g/l以生药计，于冰箱内冷藏保存。1.2试剂与药物龙胆苦苷对照品中国药品生物制品检测定所，批号：770-200105。乙腈、甲醇美国TEDIA，色谱纯，水为去离子水，其余试剂均为分

4、析纯。1.3仪器日本岛津L-20A系列高效液相色谱仪(包括L-20AT输液泵、DGU-20A5在线、脱气机、SPD-20AV紫外检测器、SL-20Avp系统控制器、L-slutin色谱工作站)。Explrer电子分析天平(hausrpratin，美国)；UV-2550型紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；高速台式离心机上海安亭科学仪器厂。1.4动物家兔1.52.5kg，普通级,由宁夏医科大学实验动物中心提供。转贴于论文联盟.ll.2方法与结果2.1色谱条件色谱柱为SHI-PAKVP-DS1504.6,5;流动相为甲醇-乙腈-水51085；检测波长271n；流速1.0lin-1。2.2系列对照品

5、溶液的配制精细称取龙胆苦苷对照品0.00683g至5l容量瓶中,甲醇溶解，定容至刻度,得浓度为1.366gl-1标准贮备液，分别稀释成6种不同浓度的系列对照品溶液，密封、低温、避光保存备用。2.3血清样品的预处理微量移液器汲取经预处理的兔血清200l于2l离心管中，加600l甲醇沉淀蛋白，于涡旋混合器上充分混合30s，离心16000rin-110in，取上清液，经0.22的微孔滤膜滤过，取续滤液10l进样得色谱图1。空白血清在5in之前有色谱峰，5in后再无色谱峰出现。在一样的HPL流动相条件下，与龙胆苦苷对照品的保存时间相比拟，确认龙胆苦苷样品，在上述色谱条件下别离良好，空白血浆内源性物质无

6、干扰。2.4HPL法测定秦艽中龙胆苦苷血药浓度2.4.1对照品标准曲线制作取空白血清，参加标准品的血清溶液，配置成6种所需不同浓度的系列标准血清样品，按照“血清预处理项下操作后测定峰面积，以龙胆苦苷的浓度为横坐标，以测得的相应峰面积为纵坐标，用最小二乘法进展线性回归。得回归方程A7922.7456.52，R20.9995，线性范围0.683136.6gl-1，最低定量浓度为0.0342gl-1。见图2。2.4.2回收率实验精细移取200l空白血清，参加标准品的血清溶液，配制成高、中、低浓度3组各5份，照“2.3项下操作,计算平均方法回收率。结果见表1。表1龙胆苦苷回收率实验数据略2.4.3精细

7、度实验取空白血清，参加标准品的血清溶液，按“回收率实验项下配制不同浓度空白血清样品各5份，分别测定计算各浓度日内精细度，并连续测定5d，计算日间精细度。结果见表2。表2龙胆苦苷精细度实验数据略2.5给药及血液采集取安康家兔6只，秦艽水煎醇提液按2l/kg耳静脉注射给药。给药前取空白血清，给药后分别在0.08，0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，4，6，8h经耳中动脉取血，约1l/次，置于具塞离心管中，静置10in后，以3000r/in离心10in，别离血清，在低温冰箱冷冻保存至测试时。2.6样品测试从冰箱中取出待测血清样品，室温下自然解冻，血样经乙腈预处理后,进展HPL分析,色谱条件同

8、“2.1项。精细量取给药后血清200l于2l离心管中，按样品测定方法和预处理方法分别测定各时间点的血药浓度。结果见图1。2.7数据处理与分析根据标准工作曲线，计算家兔血清中龙胆苦苷的血药浓度，见图2。采用DAS软件自动拟合得到有关的药代动力学参数，龙胆苦苷的分布代谢最正确房室模型为三房室模型，主要药代动力学参数Tax=0.083h，ax=45.1g/L，V=1.312L/kg，L=0.761Lh-1kg-1，t1/2=1.195h,AU(0)=30.78gL-1h-1。3讨论随着对秦艽药用价值的研究逐步深化,对秦艽成品药的开发也即将进入消费阶段，研究秦艽制剂的体内过程，对秦艽成品药的开发有一定的参考价值。兔耳静脉注射秦艽水煎醇沉液，进展单剂量药动学研究，其ax到达45.1g/L,能准确的用HPL进展定量测定。此方法准确、简便、快速,可用于秦艽中龙胆苦苷的微量检测。用DAS2.0软件处理显示龙胆苦苷的分布代谢最正确房室模型为三房室模型，说明龙胆苦苷在体内能维持较长时间稳定的治疗浓度。【