病原菌的分离培养和纯化

1、普通植物病理学实验十七、病原菌得分离壇养与纯化一、目得要求了解分离与纯化微生物得基本原理及方法。掌握倒平板得方法与组织分离、稀释分离、平板划线分离得基木操作技术。掌握在平板、斜而及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状得方法。二、基木原理植物病原菌得分离培养,就是植物病理实验室工作中得基本技能。为了获得某微生物得纯 培养，一般就是根据该微生物关于营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它 们适宜得生活条件， 即让病原菌生活在适宜得培养基上，或加入某种克制剂造成只利于此菌生长，而克制其她菌生长得环 境，从而得到纯菌株。植物病原真菌得分离方法主要有组织分离法与稀释分离法两种。最常用得方法 就是组织

2、分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量抱子得病原真菌得分离。病原细菌得分离 方法以划线分离法为最常用，在有些情况下也采用稀释分离法。为了获得分离菌得纯培养，必需要进 行分离菌得纯化，纯化得方法类似于分离工作中采用得稀释分离法或划线分离法。三、材料、仪器与用具1材料(依当地情况进行选择，下列材料供参)(pyricu 1 a ria orycae)o(exserohum t urcicum)。玉米弯抱菌叶斑病叶(c u r V u laria 1 u n ata)o(4 )玉米小斑病叶(bipo I aris may is L(5) 番茄灰霊病果(botrvt i s cinefca)。(6

3、(scicrotinia s c 1(7(pseu 0 monerolio r as syringa e pv.lach r y mans) o(8)水稻白叶枯病叶(xanth omonascampe s tmspv、o r ycuc)。大豆细菌性斑点病叶(psc U omonas syringacpv. g ly c i n ca)o（10）白菜软腐病叶（eru niacar otovora sub sp.c arotovora） 2培养基pa培养 基肉胃蛋白腺培养;加寄主组织煎汁得培养基等。3 仪器与用品超镜工作台、培养箱、培养皿、吸管、吸水纸、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、檢子、接种铲（针）

4、、接种环（银）70%酒精、01 %升汞、酒精灯、火柴、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉、锅等0 升汞溶液配:升汞1 e浓盐酸2.5 ml蒸慵水1000m 1 o先将升汞溶于盐酸中待充分溶解后，再加水稀释。升汞就是剧毒药物，在操作时应待别小心。四、实验操作（一）病原貞菌得分离组织分离法依照以下步骤进行:（1）取火菌培养皿一个置于湿纱布上，在皿盖上用玻璃铅笔注明分离日期、材料与分离人得姓名。提示:为了保证无菌操作，应注意下而几点：工作前最好将所需得物品都放在超净工作台内，工 作中临时去取容易带来杂菌;保证工作人员自身得洁净,工作前用肥皂洗手：无菌操作前还要用 7 0%酒 精擦拭双手;工作中，特別在使用

5、无菌操作间时，呼吸要轻，不要说话。（2）252（可减少细菌污染），Ocpa1015m 2520多黏霉素b （5 0 ug/ml）可以克制g（40 g/ml（50ug/ni 1 ）可以克制大部分细菌得生长。除了氯每素可在灭菌前加入外，45c（）平板进程中只要遵循“稳、轻、快要领，不必在火焰上方，一般很少污染。（3）取真菌叶斑病得新鮮病叶（或其她分离材料）选择典范得单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘（病健交界处）切取小块（海边长 3- 4mm）病组织数块。提示 :选择新想病得组织作为分离 得材料，可以减少腐生菌混入得机会。腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败得部分滋生,因此，一 般斑点病害应在临近

6、健全组织得部分分离。将病组织放人70%洒精中浸3-5 S后,按无菌操作法将病组织務人0. 1%升汞液中诀别表面消毒05、1、2. 3. 5rain(也可使用其她表而消毒)，如植物组织柔嫩呗9表而消毒703s理得时间较短(一般数秒至lmin)o30S30min3, 5mmo用无菌操作法将病组织移至平板培养基上，毎皿内放46块。提示:在将病组织小块移放到平板面之前，应将其在无菌吸水纸上吸去多余得水，以大大减少病组织附近出现细菌污染。2512034若病组织小块上均长岀较为一致得菌落，则多半为要分离得病原菌。在无菌条件下，用25C离工作。2稀释分离法00ml。到第二个培养IIIL4550c1 225%

7、乳酸)摇匀，凝固，要使培养基与稀释得菌液充分混匀提示 :倒平 板时得培养基温度一泄要掌握好，过热易将病原菌盪死而使分离失败，过冷则倒入培养皿中后难以形成 平板4 5 5 Oco(251 3(6)挑菌。将培25C病组织材料进行细菌学初步诊断即经过镜检确认有喷菌现象以后才关于该病组织作分离工 作。稀释分离法就是彊经典得标准分离法，方法同上述真菌分离。除去上述稀释分离法以外，较为方便得就是划线分离法:预先把熔化好得肉膏蛋白腺培养基倒在培养皿中，凝成平板后，翻转放在30c恒温箱中2-4h表面无水滴凝结。也可凝成平板后宜接使用。将病组织先用0升汞表而消毒05-2mini再用无菌水换洗3次后，放在火菌培养

8、中得灭菌水中，用灭菌玻棒研碎，并且让组织碎块在水中浸泡2 0-60m i 让细菌释放到火菌水中 0用灭菌得接种钢（接种环）薩取浸泡液在干燥得培养基平板表而划线，尽快不要把平板表批线与第二批线上得细菌数量相差很大。1 -3仔细挑取病原菌得单菌落，并且移植到斜而培养基上。同时，再把单菌落用灭菌水稀释成悬浮己获得纯培养。最好要经过连续三次单菌落得分离，才能确保纯化。（三）真菌、细菌培养性状观察1真菌培养性状观察取己分离、纯化得某种真菌菌种按前述稀释分离法中（ 1）-（5）透到培养基中、菌落生长速度快慢等。同时要记载培养基种类（成分及ph）与培养温度、光照条件。2 细菌培养性状观察殊气味形成等。同时要

9、记载培养基种类（成分及P h）与培养温度、光照条件。用接种银（环）醮细菌菌种后，经过无菌操作在肉膏蛋口陈等斜而培养基表面从下向上划一23（成分及ph）0用接种钳（环）养基中就是否变混浊、就是否有色素、气体、沉淀生成培养液表而就是否可生成菌膜等。也要 记载培养基种类（成分及ph）与培养温度、光照条件。五、所需时间流程病原真菌分离组织分离：切取病组织，表而消毒，无菌水洗移人平板稀释分:配子悬液倒平板i I培养7-1 0 分离菌移人斜面30min培养7-1 O检査斜而上分离菌产砲30mm保存菌种2病原细菌分离划线分离:倒平板沾菌悬液划线.12稀释分离3.病原真菌、细菌菌落培养性状观察平板上形成单菌落

10、1 3观察迦些写报告4病原细菌菌苔培养性状观察斜而上形成菌苔i3观30min写报告5病原细菌液体培养性状观察接菌于液体培养基30m i n培养2-3观察3 0 min写报六、实验作业1、上交分离得病原真菌、细菌菌种。七、思考题1如果要分离得病原真菌就是鞭毛菌中得腐德菌、疫瞪菌等应当如何进行才会获得更好得效果？2在分离病原貞菌时，向平板培养基中加人乳酸为什么会大大减少细菌得污染？3如果要从土壤中分离某种病原菌，应当采取什么样得分离方法会更有效？4.观察记载頁菌及细菌得培养性状有何意义？怎样才能知道您获得得病原真菌、细菌菌种就是否就是纯培养？附 1 常用得几种典范得病原菌分离方法1 斑点病原菌得分离。从病斑部分切取每边3-5mn得小块组织，在70%洒精中浸数秒钟后，移人0J %得升汞水溶液中处理 3-5 r aim 以灭菌水冲洗 3 次，移置培养皿得培养基中，然7096菌水冲洗几次，移脊培养基而上。得分离法，材料大得则可以用维管束组织内病原得分离法。4肉质组织中病原菌得分离。多肉得根、茎及果实等，可以采用维管朿组织内病菌分离法除去表面组织，切取小块病组织分离。如有杂菌感染可采用“直接接种法，待出现症状后，用此法再行分 离。5 种子内病原菌分离。将整