CFSE法检测刺激剂对淋巴细胞增殖与活化

1、CFSE法检测刺激剂对淋巴细胞増殖与活化薛妮娜;董凯;来芳芳;黄蕊;陈晓光【摘 要】研究不同刺激剂对人外周血淋巴细胞增殖与活化的影响.采用密度离心法 分离人外周血淋巴细胞,并采用1pmol/L的CFSE进行标记，通过流式细胞术技术检 测刺激剂抗CD3/28抗体、植物血凝素(PHA)和佛波酯(PMA)培养72 h对淋巴细 胞分裂与增殖的影响并采用ELISA法检测不同刺激剂对淋巴细胞上清IFNy质量 浓度的影响.0.125 pg/mL的抗CD3/28抗体和5或10 pg/mL的PHA可以显著 诱导CFSE绿色荧光逐渐递，形成类似五指峰样图谱,说明这两者具有很强的诱导 淋巴细胞分裂与增殖的作用相比之

2、下，单用PMA促进淋巴细胞分裂与增殖的作用 较弱此外，抗CD3/28抗体、PHA和PMA均可增加淋巴细胞IFNy的分泌，但其作 用强度如下:抗CD3/28抗体PHAPMA采用CFSE标记法检测淋巴细胞增殖的 实验,得出抗CD3/28抗体和PHA是高效的淋巴细胞活化刺激剂，而且最佳质量浓 度分别为 0.125 pg/mL 和 10 pg/mL.%The aim of this paper is to investigate the effect of different stimulants on the proliferation and activation of human periphe

3、ral blood lymphocytes. Human peripheral blood lymphocytes were isolated by density centrifugation and labeled with CFSE with the final concentration of 1pmol/L. Flow cytometry analysis was used to detect the division and proliferation of lymphocytes after administration of anti-CD3/28 antibody, phyt

4、ohemagglutinin (PHA) and phorbol ester (PMA) for 72 h. In addition, IFNy content that reflects the activation of T lymphocytes was detected by ELISA method.And found that 0.125pg/mL of anti-CD3/28 antibody and 5 or 10pg/mL of PHA could induce the gradual reduction of green fluorescence, with a Multi

5、-peak pattern inflow cytometry analysis, the results indicated that both anti-CD3/28 antibody and PHA are potential had strong stimulants for lymphocyte division and proliferation. In comparison, the role of PMA alone in promoting lymphocyte division and proliferation was weak. Furthermore, anti-CD3

6、/28 antibody, PHA and PMA almost could increase the IFNy secretion from lymphocytes. However, anti-CD3/28 antibody was the most stimulator,PHA, and PMA was the weakest agent for stimulating the production of IFNy in lymphocytes. In the CFSE-based proliferative assays for assessment of T cell functio

7、n, this paper concluded that both anti- CD3/28 antibody and PHA were effective stimulants for the proliferation and activation of lymphocytes, with the optimal concentrations of 0.125 pg/mL and 10 pg/mL, respectively.期刊名称】哈尔滨商业大学学报(自然科学版)期刊名称】哈尔滨商业大学学报(自然科学版)年(卷),期】2017(033)002【总页数】6页(P129-134)【关键词】

8、淋巴细胞增殖；CFSE；干扰素Y；流式细胞术【作 者】 薛妮娜;董凯;来芳芳;黄蕊;陈晓光【作者单位】 中国医学科学院药物研究所,天然药物活性物质与功能国家重点实验 室/创新药物非临床药物代谢及PK/PD研究北京市重点实验室，北京100050;中国 医学科学院药物研究所,天然药物活性物质与功能国家重点实验室/创新药物非临床 药物代谢及PK/PD研究北京市重点实验室，北京100050沖国医学科学院药物研究 所,天然药物活性物质与功能国家重点实验室/创新药物非临床药物代谢及PK/PD 研究北京市重点实验室,北京 100050;中国医学科学院药物研究所,天然药物活性物 质与功能国家重点实验室/创新药

9、物非临床药物代谢及PK/PD研究北京市重点实验 室,北京 100050;中国医学科学院药物研究所,天然药物活性物质与功能国家重点实 验室/创新药物非临床药物代谢及PK/PD研究北京市重点实验室，北京100050【正文语种】中文中图分类】R446肿瘤免疫治疗己成为继手术、化疗和放疗之后的第四种常用的肿瘤治疗方法.肿瘤 免疫治疗是通过激发或调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境的抗肿瘤免疫能力， 从而控制和杀灭肿瘤细胞而效应T淋巴细胞是诱发有效的抗肿瘤免疫反应的主要 执行者，行使对肿瘤细胞的识别和消灭作用1.在肿瘤进展过程中，肿瘤细胞通过 上调一些免疫检查点分子的配体，与T淋巴细胞表面这些共抑制性受体

10、(PD1、CTLA4、LAG3等)相互作用，从而抑制T细胞的增殖与活化，形成肿瘤免疫逃逸 微环境2-3.目前，绝大多数上市或处于临床研究阶段的抗肿瘤免疫药物都是通过 抑制T细胞的负性调控信号，通过激活T淋巴细胞的增殖和活性，强化T细胞的 免疫应答，最终达到抵御肿瘤细胞增长的目的.因此，T淋巴细胞的增殖与活性水 平的检测是细胞免疫功能研究的常用方法，也是目前抗肿瘤免疫药物研发中一个重 要的考察指标4.氚标记胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法被广泛用于淋巴细胞增殖的检测但是其需要 使用放射性同位素标记，具有潜在的污染，并且不容易大批量操作.其次，还有一 些研究者采用MTT或MTS的方法检测淋巴细胞

11、增殖虽然MTT或MTS的操作方 法相对简单，但灵敏性不高，且此方法不适合检测一些具有氧化还原性作用的药物， 这类药物可直接与MTT反应，造成假阳性此外，3H-TdR掺入法和MTT/MTS法 均是以细胞的数量来反应增殖的变化，不能反应细胞的分裂情况，且无法测定不同 亚群淋巴细胞的增殖情况5-6羧基荧光素乙酰乙酸(Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester, CFSE )染色是一种有效的检测淋巴细胞分裂与增殖 的方法.CFSE可穿过细胞膜，不可逆地与细胞内的氨基共价结合偶联到细胞内蛋白. 在细胞分裂增殖过程中，CFSE标记的荧光可平均分配到两个子

12、代细胞中，出现连 续的荧光强度递减现象，在流式细胞术检测过程中出现类似“五指峰”的特征7- 8.抗CD3/28抗体、刀豆蛋白A(ConA)、植物血凝素(PHA)佛波酯(PMA)可刺激小 鼠脾或人外周血T淋巴细胞增殖目前，文献中尚未对这些刺激剂促进T淋巴细胞 增殖的强度进行比较.而且报道的这些刺激剂的最佳有效剂量也不尽相同.因此，本 文采用CFSE标记法检测不同刺激剂诱导人外周血淋巴细胞分裂与增殖的活性，为 验证肿瘤免疫药物的活性提供有效的评价方法.全血 健康志愿者的抗凝血购自中国食品药品检定研究院.主要试剂人外周血淋巴细胞提取分离液购自达科为生物技术有限公司.CFSE、PMA、和PHA购自Si

13、gma公司，人源抗CD3、CD28抗体购自美国Miltenyi?Biotec公司. 人源IFN y的ELISA检测试剂盒购自cloud-clone公司.RPMI1640培养基和胎牛 血清购自美国GIBCO公司.主要仪器FACSVerse流式细胞仪为美国BD公司产品，Synergy H1多功能酶标仪为美国 Bio-Tek公司产品，CO2培养箱为日本三洋公司产品，冷冻离心机为美国Sigma 公司产品.淋巴细胞的制备将健康志愿者的抗凝血与PBS混合，再缓慢加至淋巴细胞分离液中(这三者的终体 积比例为1:1:1）,室温，800 r/min离心30 min,小心吸取中间的一层薄而致密 的白膜（淋巴细胞层

14、）至另一层离心管中，用PBS重悬洗涤2次，计数，调整细胞 浓度为1x107/mL.CFSE标记淋巴细胞在上述淋巴细胞悬液中加入CFSE染液（CFSE，终浓度为1 pmol/L）,37 C避光孵 育10 min ,每5 min混匀细胞加入预冷的2 mL灭活牛血清冰上终止2 min , 1 500 r/min离心5 min，用预冷的含10%灭活胎牛血清的PBS洗涤2次离心，用 含10%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬，计数，将细胞调整为3x106/mL,加 入96孔圆底板，每孔100 mL,洗涤及离心过程中注意避光.流式细胞术检测淋巴细胞增殖活性向上述接种至96孔圆底板的淋巴细胞中分别加入10

15、0 mL含不同剂量的刺激剂的 RPMI1640完全培养基：抗CD3/28抗体（终质量浓度：0.125、0.5、1、1.5 pg/mL）、PHA（终质量浓度：1、5、10 pg/mL）和 PMA（终质量浓度：1、5、10 ng/mL）.每组实验做三个平行孔，置于37C, 5%CO2细胞培养箱中继续孵育72h. 离心，收集细胞上清，冻于-80 C冰箱保存将细胞用预冷PBS洗涤2次，并用 200 pL PBS重悬，采用流式细胞检测仪（BD FACS Verse ）检测淋巴细胞的分裂和 增殖情况，并采用Flowjo 7.6软件计算淋巴细胞增殖情况（CFSE荧光强度减低的 细胞百分比）和分裂指数（CFS

16、E荧光强度减低的细胞百分比与CFSE荧光强度不变 的细胞百分比的比值）.ELISA法检测淋巴细胞上清IFNy质量浓度取上述条件下淋巴细胞上清液，采用ELISA法检测IFNy的质量浓度操作步骤参 照试剂盒说明书简要步骤如下：1）加入100 pL倍比稀释的人源IFNy标准品及淋 巴细胞上清原液，室温静置1 h ; 2）充分弃上清，分别加入1:100稀释的IFNy 的一抗，室温静置1 h ; 3）弃上清，洗涤三次后，加入1:100稀释后的IFNy的 二抗，室温静置30 min ; 4)弃上清，洗涤5次后，加90 pL底物(TMB)显色，室 温避光放置15 min ; 5)加50 pL的硫酸终止反应；

17、6)酶标仪450 nmol/L下检测 淋巴细胞培养上清液中IFNy的含量.统计分析数据采用Mean士SD表示，用SPSS17.0软件对实验数据进行显著性分析， PS0.05具有统计学意义.3.1 CFSE法淋巴细胞增殖实验中细胞门的确定采用Flowjo 7.6软件对淋巴细胞分裂与增殖进行分析.根据前向散射角(FSC)和侧 向角散射(SSC)显示图，发现排除了细胞碎片群外，在正常条件下，淋巴细胞主要 分布为左下群，均一度较好的一簇细胞群.在接受不同刺激剂活化后，左下的淋巴 细胞群开始往右上方移动，且出现比较散在的细胞群.根据流式细胞术的原理，我 们认为在刺激剂活化淋巴细胞后，淋巴细胞出现不同程度

18、的分裂和增殖，其细胞大 小和均一度都发生改变，从而显示在右上方散在的细胞群.我们把原始淋巴细胞命 名为R1门，刺激剂活化后的淋巴细胞命名为R2门(如图1(A) (B)所示)且在正常 条件下，R1门的细胞具有强的CFSE染色荧光(单峰)；在刺激剂作用下，R2门内 增殖的淋巴细胞出现逐渐递减的CFSE染色荧光(多峰)(如图1(C) (D)所示).3.2抗CD3/28抗体对淋巴细胞分裂与增殖活性的影响抗CD3和CD28抗体分别在体外模拟特异性T淋巴细胞活化的第一信号和第二信 号，是T淋巴细胞活化常用的刺激剂我们采用CFSE染色，通过流式细胞术检测 抗CD3和CD28抗体对淋巴细胞增殖的影响如图2(A

19、) (B)所示，抗CD3/28抗 体可以强效地诱导绿色荧光强度逐渐递减，形成类似“五指峰”样图谱，说明抗 CD3/28抗体可以显著促进淋巴细胞分裂和增殖且在0.125 1.5 pg/mL剂量范 围内，抗CD3/28抗体诱导的“五指峰”图几乎重叠对其增殖指数和分裂指数进 行统计，如图2(C) (D)所示，0.125 1.5 pg/mL的抗CD3/28抗体诱导淋巴细 胞增殖百分比基本可达到75%(PSO.OO1),其诱导淋巴细胞分裂指数可达3倍 (PS0.001).但随着抗CD3/28抗体质量浓度的增加，1.5 pg/mL的抗CD3/28抗 体诱导淋巴细胞分裂指数反而有所下降.因此，在诱导淋巴细胞

20、增殖实验中，选用 终质量浓度为0.125 pg/mL的抗CD3/28抗体即可.PHA对淋巴细胞分裂与增殖活性的影响PHA是一种有丝分裂原，主要用于激活淋巴细胞对PHA的不同质量浓度进行分 析表明，PHA可以剂量依赖性地促进淋巴细胞分裂与增殖.1 pg/mL的PHA促进 淋巴细胞增殖和分裂指数分别为40.9%和0.69倍.当质量浓度为10 pg/mL 时， PHA促进淋巴细胞增殖的效果最为明显，淋巴细胞增殖和分裂指数为85.7%和 4.7倍(如图3所示).PMA对淋巴细胞分裂与增殖活性的影响PMA是PKC信号的激活物，PKC信号在T淋巴细胞活化中占据重要地位所以PMA 也是 T 淋巴细胞活化常用

21、刺激剂之一.对 PMA 的不同质量浓度进行分析表明， 虽然PHA也可剂量依赖性地促进淋巴细胞分裂与增殖，但其诱导淋巴细胞增殖能 力较弱，5 ng/mL和10 ng/mL的PMA诱导淋巴细胞增殖指数才到达20%，此 剂量下的分裂指数才达到0.2倍(如图4所示).3.5不同刺激剂对淋巴细胞IFNy分泌的影响收集不同刺激剂培养淋巴细胞72h后的上清液，采用ELISA法检测IFNy的质量 浓度如图 5 所示,0.125 pg/mL 抗 CD3/28 抗体、10 pg/mL PHA 和 10 ng/mL PMA均可显著增加淋巴细胞IFNy的分泌(PS0.001)但其增加淋巴细胞IFNy分泌 量的顺序是抗

22、CD3/28抗体PHAPMA.淋巴细胞增殖实验是评价机体免疫功能的常用方法.CFSE染色法是近年来广泛代替 3H-TdR掺入法和MTT显色法的一种快速、无污染的检测淋巴细胞增殖的方 法.CFSE染色结合流式细胞术技术能在不同淋巴细胞亚群及单个细胞水平上动态的 分析淋巴细胞增殖情况9-11.小分子药物单独作用在体外几乎不刺激淋巴细胞增殖，需要在淋巴细胞活化的基础 上，进一步评价小分子药物调节淋巴细胞增殖的作用因此，采用CFSE法，寻找 不同刺激剂活化淋巴细胞的最佳剂量，是评价调节淋巴细胞增殖的小分子药物的必 要前提本实验采用人外周血提取获得淋巴细胞，在不同剂量的抗CD3/28抗体、 PHA和PM

23、A作用下，观察淋巴细胞的增殖和分裂指数实验中发现，比以往报道 用量更低的抗CD3/28抗体(0.12 5pg/mL)即可高效的刺激T淋巴细胞的分裂与增 殖12.5 pg/mL的PHA促进淋巴细胞增殖和分裂指数分别为75%和3倍，这与 Fulcher D等研究者的报道一致7.由于PHA可以剂量依赖性地增加淋巴细胞增殖 与分裂，可根据需要活化的淋巴细胞的强弱选择合适的PHA的剂量，同时，PHA 又便宜因此，PHA可用于调节淋巴细胞增殖的化合物的大量筛选相比之下，PKC 信号的激动剂PMA促进淋巴细胞增殖的能力较弱可能是因为T淋巴细胞的活化 需要PKC信号和Ca2+信号共同参与，因此单一的PMA对淋

24、巴细胞的活化作用 较弱，需要与离子霉素联用(Ca2+激动剂)可能对显示出更强的促进淋巴细胞增殖 的活性这与Castagna M等人的研究相一致13.IFNy是T淋巴细胞活化的重要 指标14-15.实验发现抗CD3/28抗体、PHA和PMA都能显著增加淋巴细胞 IFNy的分泌，也证明了这三类刺激剂对T淋巴细胞的活化作用并且这三种刺激剂 增加IFNy的分泌的程度与其诱导淋巴细胞分裂与增殖的程度相对应.后续将进一步 研究这些刺激剂对不同亚群T淋巴细胞的促增殖作用.【相关文献】 LANITIS E, POUSSIN M, KLATTENHOFF a W, et al. Chimeric an tige

25、n receptor T Cells with dissociated signaling domains exhibit focused antitumor activity with reduced pote ntial for toxicity in vivo J. Can cer imm uno logy research, 2013, 1(1): 43-53.YAO S, ZHU Y, CHEN L. Advances in targeting cell surface signalling molecules for immune modulation J. Nature revi

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