针刺对脑缺血再灌注模型大鼠海马 caspase3 mRNA 表达的影响

1、1材料和方法1.1实验动物选择及分组选用中国科学院上海斯莱克实验动物提供的安康雄性成年SD大鼠50只，体重25030g，随机分为正常组、假手术组、模型组、穴位针刺组、非穴位针刺组。1.3模型制备参照Lnga(1989年)线栓法并加以改良：SD大鼠用10%水合氯醛(0.3L/100g体重皮内注射)麻醉，仰卧固定。颈部正中切开皮肤，钝性别离左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，仔细别离防止损伤迷走神经。由颈外动脉远心端结扎颈外动脉，用微型动脉夹夹住颈总动脉近心端及颈内动脉，在靠近颈总动脉分叉处用眼科剪在颈外动脉上剪一小口，将直径0.26的尼龙钓丝涂有石蜡的一端沿小口插入颈总动脉，剪断颈外动脉远心端，使

2、颈外动脉和颈内动脉处于同一直线上，移去颈内动脉的动脉夹，经颈总动脉分叉处将鱼线缓慢向颈内动脉入颅脑内的方向推进约17-18，微遇阻力时停顿，使鱼线头端到达较细的大脑中动脉起始处。缚紧预先放置于穿刺小口处的丝线，缝合，消毒，于缺血2h后拔出栓线，建立缺血再灌注模型。假手术组大鼠只别离暴露颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，结扎颈外动脉。正常组不进展手术处理。再灌注2h后进展神经行为学评分，同时电针治疗。评分标准参考Bedersn6级5分法：正常为5级(0分)；对侧上肢不能完全伸展为4级(1分)；向对侧推时抵抗力下降为3级(2分)；提尾时向对侧转圈为2级(3分)；自动转圈为1级(4分)；无自发性活动、意

3、识障碍为0级(5分)。神经行为学评分到达1-4分视为造模成功。1.4干预方法穴位针刺组取穴：根据中国针灸学会实验针灸研究会制定的“动物针灸穴位图谱，取内关(双侧)、人中、百会、风府。非穴位针刺组取穴：上述各穴向左侧平移0.5处，共5个点。1.5标本处理大鼠经再灌注24h后，用10%水合氯醛(0.3L/100g体重皮内注射)腹腔注射麻醉大鼠，确定麻醉后大鼠仰卧位固定，用剪刀沿胸骨切一纵行切口，充分暴露心脏，于左心尖处剪一小口，用一支12号灌胃针从小口插入左心室到达主动脉处，并固定；将灌胃针和输液瓶接通，剪开右心耳，滴注37温浴的生理盐水150L，直至右心耳流出液变成清亮，再滴注4%多聚甲醛磷酸缓

4、冲液(含1DEP)大约200L固定。断头取脑，从嘴侧到尾侧冠状切片，切成5等份厚度的脑片，取尾侧的第2片放入4%多聚甲醛(含1DEP)中继续固定1h后，移入75%酒精脱水中止固定。标本入LEIaTP1020全自动组织处理仪进展脱水、透明、浸蜡12h左右，然后石蜡包埋；镜下定位，确定海马部位后切片，片厚5。1.6原位杂交检测按照操作说明书操作：切片脱蜡至水后入3%的过氧化氢溶液中孵育10in，以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水洗3次后胃蛋白酶消化10in。然后PBS洗3次蒸馏水洗1次，1%甲醛磷酸缓冲液固定10in。再蒸馏水洗3次后40恒温箱中预杂交3h，加杂交液，40恒温箱中过夜。用37SS

5、溶液杂交后洗涤，加封闭液3730in，生物素化鼠抗地高辛3760in，PBS洗涤4次，加SAB3720in，PBS洗涤3次，加生物素化过氧化物酶3720in，PBS洗涤4次，滴加新颖配置的DAB溶液进展显色，以蒸馏水冲洗终止反响，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。采用北京航天航空大学的图像分析系统进展图像分析。400倍光镜下，均在左侧海马A1区取3个视野，每个视野随机取10个阳性细胞，计算各组阳性细胞的平均光密度和平均灰度。图像分析系统提供的平均灰度和平均光密度两个测量指标，反映原位杂交抗原抗体反响后细胞内阳性表达物质的含量变化。阳性表达物质越多棕色沉淀颜色越深，平均灰度数值

6、越小；而平均光密度是表征光的透过情况的，阳性表达物质越多光的透过就越少，其数值越大。1.7统计分析：使用SPSS11.5版统计学软件处理，检测结果以均数标准差(s)表示，多组间差异的显著性采用单因素方差分析(F检验)，用DunnettT3法进展组间的两两比拟。转贴于论文联盟.ll.2结果2.1各组大鼠神经行为学评分见表1。表1大鼠神经功能评分(s)组别再灌后2h再灌后24h正常组00假手术组00模型组2.450.69#2.150.74#穴位针刺组2.460.65#1.461.03#非穴位针刺组2.301.14#1.560.95#注：#与正常组、假手术组比拟P0.05；与模型组比拟P0.05；与穴位针刺组比拟P0.05；组内再灌后2h与再灌后24h比拟P0.05。组别平均光密度平均灰度正常组0.270.02138.996.85假手术组0.280.03#137.889.60#模型组0.370.06#112.7915.32#穴位