DOC2抑制对宫颈癌SiHa细胞系的生长

1、D0C2卬制对宫颈癌SiHa细胞系的生长作者：李萍，辛晓燕,刘淑娟，宋庆贺,毛敬作者：李萍，辛晓燕,刘淑娟，宋庆贺,毛敬【关键词】宫颈癌Inhibitory effect of D0C2ene on growth of hiiiKncervical cancer SiHa cellsInhibitory effect of D0C2ene on growth of hiiiKncervical cancer SiHa cellsLAbstract AIM: To explore the inhibitory effect of DOC2 gene on the growth ofhuma n.

2、 cervical can cer cell li ne SiHa. METHODS: Rebinant eukaryotic expression vector(containingexogenous humemDOC2cDNAandvector1 (with n eomyci n resists nee gene only) were tran sfected into： huma n cervical can cer SiHa cells (no DOC2 gene exp ressi on) with lipo fectami ne resp actively. The growth

3、rate, cell cycle and colony formatio n rate of tran sfected cells were observed by MTTassay and FCMassay res pectively. RESULTS: The growth of SiHa tran sfected with D0C2 gene was markedly suppressed ( Pv) . Colony formation rate in soft agar was also decreased significantly ( Pv) . Cell cycle analy

4、sis showed that the percentage ofcells in Glp hase of SiHa p93 cells was sig nificia ntly in creased while thatof cells in S phase was decreased. The percentage of cells in the different p hases of thecycle did not sig nifica ntly vary betwee n the SiHa and CONCLUSIONDOC23ene can inhibit the prolife

5、ration and DNAsynthesis ofhuma n cervical cancer.huma n cervical cancer.Keywords!【摘要】Keywords!【摘要】目的：探讨卵巢癌缺失2 (D0C2基因对宫颈癌SiHa细胞系生ft长的抑制作用.方法：釆用基因转染技术，将含有全长D0C2CDN的真核重组表 达质粒和 空载体质粒()转染到人宫颈癌SiHa细胞系.(无D0C2基因的表达)中，了解其对细胞 增殖能力及细胞周期的影响.结果：转染D0C2基因的宫颈癌细胞生长受到抑制(Pv), 其在软琼脂克隆形成能力明显降低(P)- D0C2有使G1期细胞比例增高、S期细胞比

6、 例下降的趋势，但SiHa细胞和细胞之间无显著差异.结论：D0C2基因能抑制宫颈癌细胞 系的增殖.ft【关键词】宫颈肿瘤；D0C2基因疗法。引言卵巢癌缺失 2 (differentially expressed in. ovariMi cancer 2, DOC2)!基因能抑制多种肿瘤细胞系的生长，是一个新的候选的肿瘤抑制基因，为探讨!DOC基因对人宫颈癌细胞的抑制作用，我们采用基因转染技术研究其对宫颈癌 细胞增殖的影响，为宫颈癌的治疗提供思路一1材料和方法IllU!材料无DOC2基因表达的人源性宫颈癌细胞系SiHa由西京医院妇产科实验室提 供，常规方法复苏细胞并在37C , 50 mL/L

7、C02标准条件下培养.真核表达载体质粒（含 有人D0C2CDNA）空载体质粒和免疫组化试剂D0C2抗体均由刘淑娟博士惠赠1-2：. DMEM质粒转染试剂盒（Lipofectamine 20XX ）及胰蛋白 酶购自GIBC0公司：胎牛血清购 自杭州四季青;MTT购自华美生物工程公司;SABC试剂盒与DAB显色剂均购自武汉博士徳 生物技术有限公司,G418购自Sigma公司.IllU!方法取 卩L （卩g）与无血清DMEM 250卩L混匀得A液，另取hiLipofectamin20XX 5卩L和无血清DMEM50卩L混匀得B液.A与B两液混匀，室温放置20 min形成脂质体复合物（C1液）；同法制

8、备脂质复合物（C2液）.用C1液和C2液分别转 染SiHa细胞，同时设未转染的SiHa作对照.转染48 h后，向培养基中加入G418进行筛 选，瓶中G418终浓度由100 mg/L逐渐升至400 mg/L,每3d提高1次浓度，筛选抗G418 克隆，挑选阳性克隆并扩大培养.转染克隆釆用ABC免疫酶染色法检测D0C2S白的表达. 取处于对数生长期的SiHaP93细 胞，常规胰酶消化并制备SiHap93单细胞悬液，以每孔 IX 104个细胞接种于24孔培养板，每加1 mL培养基，于接种后24 h开始加入MTT,每 次6个复孔，每孔加入hi75卩L MTT（20 g/L ）37 C, 50 mL/L

9、C02孵箱孵育4 h后弃去上清，每孔 加入mL DMS0111振荡15 min,再孵育1 h,使结合的MTT充分溶解，选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪 上测定各孔A值，每日测量1次，连续7 d,并绘制A值时间曲线.测量期间每23 d换 液1次同法绘制SiHa和细胞的A值时间曲线,作为对照一用去离子水配制7 g/L和12 g/L琼脂溶液，高温高压灭菌后，于45C水浴保温备用.配制2XDMEM培养液，高温高压 灭菌后45C水浴保温.将2X DME与12 g/L琼脂溶液等体积混匀后，按1 mL/孔加入24孔 培养板，4C放 置30 min使之凝固一再将2X DMEMT 7 g/L琼脂溶液等体积

10、混匀，之后加入 SiHap93单细胞悬液并调整细胞终浓度为IX 106/L,此混悬液按每孔mL加入上 述24孔 板，铺平后室温放置使琼脂凝固,之后置于37C, 50 mL/L C02孵箱中111培养2 wk,观察细胞克隆形成情况并计算克隆形成率同时设SiHa和对照.克隆形成率（% =克隆数-接种细胞数X 100.取SiHa,和SiHap93细胞分别接种于培养瓶，培养至 80%90融合状态时，用250 g/L胰酶消化并收集细胞;PBS洗涤2次后900 mL/L乙醇固定 过夜.次日再次以PBS洗涤，并调整细胞浓度IX 10矿IX 109/L,碘化丙锭染色30 min后， 应用FCM检测，计算出各期

11、细胞百分比，每组重复3次.统计学处理：用统计软件进行统计分析，组间比较釆用完全随机设计的 方差分析，两两比较釆用LSD法，PV表示具有统计学差异.2结果S】Hap93细胞p93表达蛋白阳性产物呈棕褐色定位于细胞质.说明转染后，DOC基 因在SiHa细胞中能稳定表达（图1, 2）、比较3种细胞的生长曲线.可以看出SiHa和 细胞的生长曲线较为接近，而SiHap93细胞的生长在3d后开始明显偏低于前两者（PV）.说明SiHap93细胞在转染D0C2基因后其增殖受到抑 制（图3） . SiHa,和三组细 胞，每组测量8次，求得其均数土标准差分别为（）%,（）%, （ 土）%,经分析结果为SiHa和细

12、胞均有较高的克隆形成率，且两者之间 无显著差异；在转染P93后，SiHap93细胞的克隆形成率明显降低，与SiHa和之间差异 性显著（PV），说明D0C2寸细胞的增殖力有明显的抑制作用，另经DOC转染后受阻于G1 期的细胞增多，同时S期的细胞相应减少，而与SiHa和 之间差异显著（P表1）.图1阴性SiHa细胞p93蛋白表达SABC X 400 （略）图2转染后阳性产物定于细胞质SABC X 400 （略）图33种细胞的生长曲线（MTT法）（略）表1D0C2基因对人宫颈癌细胞周期的影响（略）aP vs SiHa 和3讨论J细胞的癌基因和抑癌基因是维持细胞正常生命活动中最重要的一些基因，当它 们

13、的基因结构发生改变和异常表达（抑癌基因不表达）时，正常增殖调控紊乱，细胞 无限生长，发生癌变.D0C2/DAB广泛存在于正常组织中，但在许多肿 瘤组织和细胞系中 低表达或无表达，提示其表达缺失是肿瘤发生的早期步骤J3-4 :.我们将含DOC2CDN的真核重组表达质粒和空载体质粒C在ETiJILipofectamin介导下，转入人宫颈癌SiHa细胞系中，经G418筛选14 d空白对照组细胞全 部死亡，而转染空载体和的细胞仍有存活，并形成克隆，说明这些克隆具有G418抗 性，即为转染成功的细胞经MTT比色法检测细胞的增殖情况，发现经p93转染后的宫 颈癌细胞，其增殖受到抑制,此外，SWap93的克

14、隆形成率明显低于和S】Ha （Pv）,也说明 经D0C2专染的宫颈癌细胞在软琼脂中克隆形成能力下降，其增殖能力受到明显抑制. 流式细胞仪的分析结果也提示D0C2有使G1期细胞比例增高、S期细胞比例下降的趋 势一 G1期是细胞的DNA合成前期，增殖旺盛的细胞G1期时间短.转染D0C2后G1期细胞 比例增高、S期细胞比例下降，说明卵巢癌细胞的分裂受到了抑制.本实验将D0C2/DBA 基因转入人宫颈癌细胞中并获得了稳定的表达，明显抑制了肿瘤细胞的生长及恶性增ETiJI殖能力，为宫颈癌的基因治疗提供实验依据.【参考文献】III1刘淑料 辛晓燕，韩军涛;，等.兔抗人DOC抗血清的制备与鉴定J：.免疫学杂

15、III2：志2：Yano Mf Toyooka S, Jsukuda 岛 et al. Aberra nt pro mot ermethylati on of huma n DAB2 in teractive p rotein (hDAB21 P) gene in lung cancers j .Int J Cancer, 20XX, 113(1);59-66Dote H, Toyooka S, Tsukuda K, et al. Aberra nt. pro mot er methylati on inhuma nDAB2iactive protein (hDAB2lR gene in breast canc