聚合酶链式反应技术及应用课件

1、2022/10/2xxx1聚合酶链式反应技术及应用 检验医学院生命科学学院2022/9/28xxx1聚合酶链式反应技术及应用 2022/10/2xxx2聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是生命科学界的重大发明，是生物技术领域中最重要的四项生物技术（即细胞融合技术、分子克隆术、蛋白工程技术和基因扩增技术）之一。PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。通过体外（试管内）扩增，可以将目的基因（或靶基因）片段百万倍的放大，从而达到极大地提高核酸分子检测的灵敏度，理论上其检测的灵敏度可以达到一个细胞、甚至一个分子的水平。 2022/9/28xxx2聚合

2、酶链式反应（polymeras2022/10/2xxx3PCR发展简史PCR的发明人，一般公认是凯利穆利斯（K. Mullis, 在Cetus公司工作期间，发明了PCR 。1983年4月穆利斯萌发了PCR的构想;1985 关于PCR 的文章首次由Cetus公司Saiki等人在 Science 上 发 表; 1987 当年7月Cetus 公司在美国获得PCR基本技术专利批准,并于当年11月推出了第一 个PCR试剂产品及第一台热循环仪；1989 Science 报道了耐热性DNA多聚酶 Taq 酶的 发现,预示着分子时代的到来；1990 Cetus科学家 D.Gelfand和S.Stoffel发明

3、了纯 化Taq DNA 多聚酶的方法；1991 TaqMan 技 术 发 表；九十年代中期PCR临床应用在国内全面展开；1998年 实时荧光PCR技术开始在中国较广泛的应用于临床检测。2022/9/28xxx3PCR发展简史PCR的发明人，一般2022/10/2xxx4引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段2022/9/28xxx4引物引物Mullis的构思DNA聚2022/10/2xxx5Kary B. Mullis 1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。2022/

4、9/28xxx5Kary B. Mullis 2022/10/2xxx6PCR的应用研究基因克隆，DNA测序，分析突变诊断细菌、病毒、寄生虫检测，诊断人类基因组工程遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱法医犯罪现场标本分析肿瘤各种肿瘤检测其他2022/9/28xxx6PCR的应用研究2022/10/2xxx7PCR技术的基本原理是DNA的半保留复制，在模板DNA、引物和四种dNTP存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促反应。在体内，DNA复制是周期性的，所以基因扩增的数量有限；PCR技术在体外利用人工合成的引物，再加上DNA聚合酶和一些合适的底物和因子，通过对温度的控制，使DNA不断位于变性、复

5、性和合成的循环中，达到扩增DNA的目的。 2. PCR基本原理2022/9/28xxx7PCR技术的基本原理是DNA的半保2022/10/2xxx8模板DNA94变性55退火72引物延伸第二次循环模板变性退火延伸图6-1 PCR原理示意图2022/9/28xxx8模板DNA94变性55退火722022/10/2xxx91234522557294时间（min）温度（）PCR的基本原理适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍2022/9/28xxx91234522557294时间（m2

6、022/10/2xxx10PCR产物生成曲线扩增产物循环次数指数扩增期扩增平台期2022/9/28xxx10PCR产物生成曲线扩增产物循环次2022/10/2xxx11PCR的特点灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个 PFU (空斑形成单位)细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速一次性加好反应液，24 小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA2022/9/28xxx11PCR的特点灵敏度高2022/10/2xxx12反应体系： （五要

7、素） 模板（template）引物(primer) 人工合成的两段寡核苷酸序列，决定RCP的特异性。3. PCR反应体系和反应条件DNA RNA：总RNA、mRNA、tRNA、rRNA、 病毒RNA基因组DNA质粒DNA2022/9/28xxx12反应体系： （五要素）3. PC2022/10/2xxx13PCR反应成功扩增的一个关键条件在于寡核苷酸引物的正确设计。引物设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。特异性是指发生错误引发的频率，特异性不好或劣等的引物会产生额外无关和不想要的PCR扩增子；引发效率是指在每一PCR循环中一对引物扩增的产物与理论上成倍增长量的接近程度。20

8、22/9/28xxx13PCR反应成功扩增的一个关键条件2022/10/2xxx14引物的长度 典型的引物为18-24个核苷酸，在一定范围内引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性；引物长度的上限主要与反应效率有关，所以一般又不能太长，因为过长会导致其延伸温度大于72，即Taq酶的最适温度。引物设计基本原则2022/9/28xxx14引物的长度 典型的2022/10/2xxx15PCR产物长度 一般来说，PCR产物长度对扩增效率有影响。扩增片段长度在普通PCR以200500bp为宜；实时荧光PCR则为50150bp。2022/9/28xxx15PCR产物长度 一般

9、来说，2022/10/2xxx16引物的均衡性和GC含量 引物中碱基组成应尽可能随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶碱基堆积现象。有效引物中(G+C)的比例为40-60%，过高(非特异性扩增)或过低（特异性降低）都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。2022/9/28xxx16引物的均衡性和GC含量 2022/10/2xxx17引物溶解温度（Tm值） 引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度. 如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度. Tm=2(A+T)+4(C+G)2022/9/28xxx17引物溶解温度

10、（Tm值） 2022/10/2xxx18引物自身 引物间3端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败; 引物3端的几个碱基与模板DNA需严格配对，并最好为低稳定性结构。 5端序列对PCR影响不如3端大，常用来引进修饰位点或标记物。 2022/9/28xxx18引物自身 2022/10/2xxx19- DNA 聚合酶(DNA polymerase) PCR发明初期，不耐热的Klenow片段耐热的Taq DNA聚合酶良好的热稳定性：92.5、95、97.5时，半衰期分别为130、40、56 min；良好的延伸效率：在7580 时延伸效率最高，每个酶蛋白分子的延伸速度可达150个核苷酸/s；

11、无35外切酶活性，缺乏校正功能；2022/9/28xxx19- DNA 聚合酶(DNA po2022/10/2xxx20dNTP: 包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP- PCR buffer:一般组成：50mM KCl, 10-50mM, Tris-Cl (室温PH8.3) ，1.5mM MgCl2 KCl：促进引物退火，高浓度KCl抑制Taq DNA聚合酶活性；Tris-Cl：调节pH值，使反应体系偏碱性；MgCl2 ：调节Taq DNA聚合酶活性、影响引物退火，PCR产物的特异性等2022/9/28xxx20dNTP: 包括dATP、dTT2022/10/2xxx211）PCR反应

12、成分（1）模板一般100ng DNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 PCR反应条件2022/9/28xxx211）PCR反应成分（1）模板 P2022/10/2xxx22（2）引物浓度 0.1-0.5 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。（3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus，水生栖热菌) 0.5-5 U/100 l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。2022/9/28xxx22（2）引物浓度2022/10/2xxx23（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误

13、碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。2022/9/28xxx23（4）dNTP2022/10/2xxx24（5） Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。对于大多数的PCR引物来说， Mg2+浓度为1.5mmol/L是适宜的，如果扩增效果不好，则调整镁离子的浓度可能会有所帮助。Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。2022/9/28xxx24（5） Mg2+ Mg2+是DN2022/10/2xxx252）循环参数变

14、性 使双链DNA解链为单链 94, 30s1min。(2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定，一般比引物Tm值约低5。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性，但特异性低。热启动：在第一轮扩增前必须使模版DNA完全变性，一般94，变性5分钟2022/9/28xxx252）循环参数热启动：在第一轮扩增2022/10/2xxx26（3）延伸 70-75,一般为72 延伸时间由扩增片段长度决定。（13 min)（4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-30次 次数过多：产生“平台效应” 错误掺入率增加2022/9/28xxx26（3）延伸2022/10/2

15、xxx274.PCR扩增产物的检测方法凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳法 、聚丙烯酰胺凝胶电泳法 PCR-限制性片段长度多态性分析法（PCR-RFLP） 单链构型多态性分析法（PCR-SSCP）核酸探针杂交法 PCR产物测序 荧光PCR2022/9/28xxx274.PCR扩增产物的检测方法凝胶2022/10/2xxx28(一)琼脂糖凝胶电泳法基本原理：DNA在电泳缓冲液中带负电荷，将PCR产物点样于负极端的加样孔，在电场力的作用下DNA涌向正极，并且由于电荷效应和分子筛效应，不同DNA分子量及构型的DNA涌动率不同；在电泳过程中，凝胶中的EB将嵌入DNA分子中，在紫外线照射下，EB-DNA复合物发出

16、橙红色荧光，荧光强度与DNA含量成正比；不同浓度的凝胶分辨DNA的有效范围不同。操作简单，但存在EB污染。2022/9/28xxx28(一)琼脂糖凝胶电泳法基本原理：2022/10/2xxx29聚丙烯酰胺凝胶电泳特点及用途特点：分辨力高，长度仅相差1bp的DNA分子即可分开；上样量远大于琼脂糖凝胶；回收的DNA纯度高；采用银染色DNA或RNA，灵敏度高，比琼脂糖凝胶电泳中EB染色法高2-5倍，而且避免EB易退色的弱点。用途：PCR扩增指纹图、多重PCR、PCR产物限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析。2022/9/28xxx29聚丙烯酰胺凝胶电泳特点及用途特点2022/10/2xxx3

17、0(二)PCR-限制性片段长度多态性分析法（polymerase chain reaction based on restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）不同的限制性核酸内切酶可识别特异DNA序列，所以用特定的限制性核酸内切酶对目的DNA分子进行消化，得到的酶切片段其大小和数量可以在一定程度上反应出目的DNA分子的序列信息用途：传染病病原体基因分型 人类基因的变异性研究。是诊断遗传病和传染病病原体基因分型的常用方法2022/9/28xxx30(二)PCR-限制性片段长度多态2022/10/2xxx31PCR-RFLP法： 限制性内切酶

18、恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）Ras基因突变限制性内切酶2022/9/28xxx31PCR-RFLP法： 限制性2022/10/2xxx32(三) 单链构型多态性分析法（PCR-Single Strand Conformation Polymorphism，简称PCR-SSCP）本法就是将PCR 产物双链DNA（dsDNA）变性为单链DNA （ssDNA），加样于变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，由于DNA 分子在凝胶中的电泳迁移率与其分子量和空间结构有关，而空间结构又与ssDNA序列有关。因此，电泳结束后，ssDNA带位置的差异即可反映出PCR产物序列的差异。2022/9/28xxx32(三) 单链

19、构型多态性分析法（P2022/10/2xxx33PCR-SSCP过程 - primer - 32P-dNTP掺入 PCR扩增 产物 变性 单链DNA 中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 2 3 4 5 自显影 1.为正常 结果分析 2、4、5纯合患者 3.为杂合子 . 解链构像DAN原 理过 程2022/9/28xxx33PCR-SSCP过程 2022/10/2xxx34优点及作用：方法简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器，适合临床实验的需要。该方法和其他方法相比有较高的检测率。首先，它可以发现靶DNA片段中未知位置的碱基突变。经实验证明小于300bp的DNA片段中的单碱基突变，90%可被SSCP发现，

20、另外，SSCP方法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离，并且还可以进一步提纯。用这种方法可以最终从DNA序列水平上鉴别突变DNA片段。不足之处：只能作为一种突变检测方法，要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序；电泳条件要求较严格；另外，由于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的，这样就可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小时，再加上其他条件的影响，使聚丙烯酰胺凝胶电泳无法分辨造成漏检。2022/9/28xxx34优点及作用：方法简便、快速、灵敏2022/10/2xxx35(四) 核酸探针杂交法(1)点杂

21、交（dot blot）(2)反向点杂交（reverse dot blot）(3)微孔板夹心杂交（microplate hybridization）(4)荧光探针杂交(5)Southern印迹杂交（Southern blot）2022/9/28xxx35(四) 核酸探针杂交法2022/10/2xxx36样品正对照负对照标准分子量 污染是PCR实验的常见问题。只要实验室里曾经扩增过某个片段，就有可能以后的实验中发生污染。因此，做实验的时候绝对不要忘了负对照。用紫外灯破坏污染物也是一个办法5. PCR常见问题及分析2022/9/28xxx36样品正对照负对照标准分子量 污染2022/10/2xxx3

22、7(1) 假阳性PCR产物是最主要的污染源。阳性对照的污染。标本之间的交叉污染。在采集标本时，其他污染源带来的污染。使用带有污染的试剂。预防措施：2022/9/28xxx37(1) 假阳性预防措施：2022/10/2xxx38(2) 假阴性假阴性是PCR反应中另一个易出现的问题。造成的原因也比较多。可以归纳以下几方面原因。1)标本处理的原因。 处理标本时，靶DNA丢失。 处理标本时，杂质成分没有去除干净，带入PCR反应中抑制了Taq酶活性。 标本放置不当，模板发生降解（尤其是RNA）。2022/9/28xxx38(2) 假阴性2022/10/2xxx392)PCR试剂问题。 引物设计不合理。

23、Taq DNA聚合酶失活。 Mg2+浓度过低或是没有加。3)PCR扩增过程中的问题 PCR扩增仪故障。 PCR扩增反应液没有加液体石蜡油。 4) PCR产物鉴定中的问题 电泳时没有加溴化乙锭。 电泳缓冲液和凝胶使用次数过多。 凝胶浓度过低，使扩增带跑散。2022/9/28xxx392)PCR试剂问题。2022/10/2xxx40(3) 引物二聚体形成引物二聚体的原因有： 两个相同的或不同的引物分子之间有较多的碱基配对，特别是引物3端有互补区。 引物比例太高，可增加模板用量。 退火温度过低。 热循环次数过多。2022/9/28xxx40(3) 引物二聚体2022/10/2xxx41(4) 非特异

24、性PCR产物造成非特异性PCR产物的常见原因及其预防措施： 引物特异性不高或用量太大，应更换引物或降低用量；TaqDNA聚合酶质量不好或用量太大，应更换酶或降低酶使用量； Mg2+浓度过高，可适当调整其浓度；退火温度过低，可提高退火温度；延伸时间过长，可减少延伸时间；热循环次数过多，应适当增加模板量，减少循环次数。2022/9/28xxx41(4) 非特异性PCR产物2022/10/2xxx426. PCR技术的发展巢式PCR（nested PCR ）逆转录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）多重PCR(multiplex PCR) 重组PCR(recom

25、binant PCR) 锚定PCR（anchored PCR, A-PCR） 不对称PCR（asymmetric PCR） 反向PCR（inverse PCR） 扩增长片段PCR（long PCR，long-distance PCR） 免疫PCR(immuno-PCR) 原位PCR (in situ PCR)差示PCR（DD-PCR） 定量PCR 2022/9/28xxx426. PCR技术的发展巢式PCR2022/10/2xxx43图6-3 巢式PCR原理示意图外引物1外引物2内引物1内引物2第一次 PCR第二次 PCR（一）巢式PCR （nested PCR ） 2022/9/28xxx4

26、3图6-3 巢式PCR原理示意图2022/10/2xxx44提高反应的特异性2022/9/28xxx44提高反应的特异性2022/10/2xxx45RNA 模板逆转录酶DNA-RNA 杂化双链RNA酶单链cDNA聚合酶双链cDNA（二）逆转录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）2022/9/28xxx45RNA 模板逆转录酶DNA-RN2022/10/2xxx46one-step RT-PCR：在同一体系中加入逆转录酶、逆转录引物、Taq DNA聚合酶、PCR引物、dNTP和缓冲液，直接以mRNA为模板进行逆转录和PCR扩增，称为一步法RT-PCR。Tth

27、DNA聚合酶具有逆转录功能和DNA聚合功能。常用的逆转录酶有AMV逆转录酶（最适温度为42）和MoMLV逆转录酶（最适温度为37），常用的逆转录引物有三种：随机引物；Oligo（dT），只适合于3端带有poly(A)尾的mRNA；特异性引物，只适合于逆转录目的RNA序列。以逆转录产物cDNA为模板，再做PCR。2022/9/28xxx46one-step RT-PCR：2022/10/2xxx47经济2022/9/28xxx47经济2022/10/2xxx48（三）多重PCR（multiplex PCR） PCR一般由一对引物扩增产生一个核酸片段，以此手段诊断疾病的效率低。为提高效率，常采用多

28、重PCR技术。该技术是在一个反应体系中加入多对引物，同时扩增出多个核酸片段，由于每对引物扩增的片段长度不同，可用电泳加以鉴别。多重PCR主要用于多种病原微生物的同时检测或病原微生物、遗传病及癌基因的分型鉴定。2022/9/28xxx48（三）多重PCR（multipl2022/10/2xxx49用于检测特定基因序列的存在或缺失。电泳引物2022/9/28xxx49用于检测特定基因序列的存在或缺失2022/10/2xxx50乳头瘤病毒（）检验及分型 宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率在女性中仅次于乳腺癌。我国每年有宫颈癌新发病例.万，占世界宫颈癌新发病例总数的.。临床科学研究表明，持续感染是

29、导致宫颈癌的直接原因。可分为高危型和低危型两种，不同的亚型在致癌性方面存在很大的差别。至今发现的病毒约有种，至少有种高危型会构成子宫颈癌。所以提早诊断感染，对尤其是高危型进行检验和分型极为重要。 2022/9/28xxx50乳头瘤病毒（）检验及分型 2022/10/2xxx51（四）重组PCR（recombinant PCR）将两个不相邻的DNA片段重组在一起的PCR称为重组PCR。该技术主要应用于DNA片段的任何位置引入点突变、插入、缺失以及两个不相邻片段的连接。其基本原理是将突变碱基、插入或缺失片段、或一种物质的几个基因片段的部分碱基设计在引物中，先分段对模板扩增，除去多余的引物后，将产物

30、混合，再用一对引物对其进行PCR扩增。所得到的产物是一重组合的DNA。2022/9/28xxx51（四）重组PCR（recombi2022/10/2xxx52引物a引物c引物b引物d53 PCR混合，变性和复性延伸异源部分双链DNA形成5555533333333333555555PCR引物a引物d 再次 PCR5533（四）重组PCR（recombinant PCR）2022/9/28xxx52引物a引物c引物b引物d532022/10/2xxx53（五）锚定PCR（anchored PCR，APCR） 用于扩增已知一端序列的目的DNA 例如，T细胞受体和免疫球蛋白基因5端具有高度可变性。20

31、22/9/28xxx53（五）锚定PCR（anchore2022/10/2xxx54（六）不对称PCR（asymmetric PCR）其基本原理是：采用两条不同浓度的引物，即非限制引物（高浓度引物）与限制性引物（低浓度引物），二者之比为50100:1。在PCR最初10-15个循环中，扩增产物主要是双链DNA（dsDNA）；第15个循环以后，限制性引物已被耗尽，非限制性引物介导的PCR就会产生大量的单链DNA（ssDNA）。尽管此时单链DNA仅以线性速率递增，但其浓度已能满足双脱氧链终止法测定DNA序列的要求。2022/9/28xxx54（六）不对称PCR（asymme2022/10/2xxx5

32、5已知序列PCR用途：未知序列的研究限制酶切点（X）限制酶切点（X）限制酶X酶切连接未知序列（七）反向PCR（inverse PCR）2022/9/28xxx55已知序列PCR用途：限制酶切点（2022/10/2xxx56（八）定量PCR（Quantitive Polymerase Chain Reaction，QPCR）以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。 定量PCR定量的理论依据：理想的扩增结 果：Y=X2n 其中Y代表扩增产物量， X代表PCR反应体中的原始

33、模板数 n为扩增次数； 理 论上PCR扩增效率为 100%，PCR产物随着循环的进行成指数增长，但实际上：DNA的每一 次复制都不完全，即每一次扩增中，模板不是呈 2 的倍增长；实际应为：Y= X(1+E)n ，其 中E 代表扩增效率：E = 参与复制的模板/总模板，通常E1，E在整个PCR扩增过程中不是 固定不变的。通常X 在 1105 拷贝、循环次数n30 时，E 相对稳定，原始模板以相对固 定的指数形式增加，适合定量分析，这也就是所谓的指数期；2022/9/28xxx56（八）定量PCR（Quantit2022/10/2xxx571PCR定量DNA 一个或两个拷贝的特定靶序列的细胞株即是

34、标准的一个理想来源，也可使用含特定靶序列的质粒DNA作为对照，将待检样品与一系列稀释的标准对照一起扩增，检测PCR产物，即可推知靶序列的含量。2PCR定量mRNA (1)mRNA相对定量靶基因的扩增产物量与内源性对照的扩增产物量的比值 (2)竞争性PCR定量mRNA (3)cRNA标准曲线法定量mRNA2022/9/28xxx572022/10/2xxx58实时荧光定量PCR（RT-FQ-PCR）与普通PCR的区别 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析；无法对起始模板准

35、确定量，无法对扩增反应实时检测普通PCR实时荧光定量PCR利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析；无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析；无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测实时荧光定量PCR利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模

36、板进行定量分析对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析；无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测普通PCR实时荧光定量PCR利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析；无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测与普通PCR的区别普通PCR实时荧光定量PCR利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析；无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测

37、2022/9/28xxx58实时荧光定量PCR（RT-FQ-2022/10/2xxx59如何对初始模板定量?荧光信号如何产生？Real time PCR 实时监测系统2022/9/28xxx59Real time PCR 实时2022/10/2xxx60实时荧光定量PCR原理定量原理介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析2022/9/28xxx60实时荧光定量PCR原理定量原理介2022/10/2xxx61实时荧光定量PCR 原理 - 扩增曲线扩增曲线图： 横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光

38、信号的收集荧光基团荧光检测元件2022/9/28xxx61实时荧光定量PCR 原理 -2022/10/2xxx62实时荧光定量PCR 原理 -荧光阈值荧光信号阈值 （threshold ）： 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99 真正的信号:荧光信号超过域值2022/9/28xxx62实时荧光定量PCR 原理 -2022/10/2xxx63实时荧光定量P

39、CR 原理 -Ct值Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数C(t) value 2022/9/28xxx63实时荧光定量PCR 原理 -2022/10/2xxx64实时荧光定量PCR 原理 -Ct值的重现性横轴：PCR反映循环数纵轴：荧光信号量Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性2022/9/28xxx64实时荧光定量PCR 原理 -2022/10/2xxx65荧光定量PCR原理理想的PCR反应：X=X0*2n非理想的PCR反应：X=X0 (1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0

40、：初始模板量Ex：扩增效率XCt=X0 (1+Ex)Ct =Nlog X0= - log(1+Ex) *Ct+ log NXCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数最后结论：Log X0与Ct呈线性关系，根据样品扩增的Ct值就可计算出样品中所含的模板量2022/9/28xxx65荧光定量PCR原理理想的PCR反2022/10/2xxx66 标准曲线（使用外参照物的定量PCR） 将已知浓度的标准品梯度稀释进行Real time PCR，就会按照起始DNA浓度由多到少的顺序等间隔得到一系列扩增曲线。再由Ct值与起始模版的对数值之间存在的线性关系，就可制作标准曲

41、线。未知浓度的样品与标品一样，也可得到Ct值，并将Ct值代入标准曲线，就可以求出未知浓度样品的起始模版量。 2022/9/28xxx66 标准曲线（使用外参照2022/10/2xxx67荧光信号如何产生？非特异性荧光标记：1、SYBR Green 特异性荧光标记：2、TaqMan3、Molecular Beacon2022/9/28xxx67荧光信号如何产生？非特异性荧光标2022/10/2xxx68 SYBR Green ISYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光（ SYBR Green 1 结合到双链DNA的小沟部位）变性时，DNA双链分开，无荧光在延伸结束阶段采集荧光信号。S

42、YBR Green 也能和非特异的双链DNA结合发光，所以必须在反应结束时做熔解曲线分析2022/9/28xxx68 SYBR Green IS2022/10/2xxx69SYBR-Green I5353SGExcitationSGSGSGSGEmission双链荧光染料 SYBR-Green I荧光染料原理示意图2022/9/28xxx69SYBR-Green I532022/10/2xxx70SYBR-Green I5353SGSGSGSGSGExcitationEmission2022/9/28xxx70SYBR-Green I532022/10/2xxx71Real-Time PCR，SYBR greenCycle 1Cycle 3Cycle 2Molecular Probe公司的一个专利产品，US Patent5,436,134 1993年7月12日申请2022/9/28xxx71Real-Time PCR，SY2022/10/2xxx72荧光强度的变化是由于温度不断升高双链DNA解离，SGI游离Tm是熔解曲线的特征值：SYBR Green I 熔解曲线分析当双链DNA解链一半时，荧光信号强度急剧下降，此时的