无缝克隆-让载体构建更简单

1、让载体构建更,分子克隆其实可以么快！每个做过分子实验的人可能都会有这样的经历：在经过次的、酶切、连接、转化之后，阳性率依旧很低，到底是哪一步出了问题？今天就给大家详解一下可以一步法快速构建同源重组载体，并且阳性率很高的方式：无缝克隆。无缝克隆技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标的片断的插入，而不需要任何限制性内切酶和连接酶。突破传统的双酶切再加上连接，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体，大大提高了工作效率。我们先来将传统克隆与无缝克隆做下比较：目的片院PCR十天半月实险没进展目的片院PCR十天半月实险没进展传统克隆无缝克隆引物设计需引入载体上

2、的酶只需要一次反应即可完成定向克切位点，产物再经过酶切、胶隆，省略酶切、酶连等过程；回收、连接后定向克隆到目的载体对酶切位点无要求，可以把目的片上；段插入到任意载体的任意位点；需要查找合适的酶切位点，购买各连接片段之间不会引入任何其他序种内切酶；列；阳性率低；可以同时克隆多个片段。多个片段，通常只能分多次拼接。无缝克隆相较于传统克隆的方式，优势显而易见，主要体现以下几点：1、可以不需要任何限制性内切酶、连接酶，也不需要磷酸化、末端补平等操作；2可同时连接多个片段，最多可达个；3、不附加任何多余序列，精确定向连接；4体系反应时间仅需，快速反应。那无缝克隆到底应该怎么做呢？下面我们就来详细了解下无

3、缝克隆其原理：在基因克隆的引物设计及目的片段的扩增阶段，V常规法是相同的。唯一的差异在于载体末端和引物末端应具有个同源碱基，由此得到的产物两端便分别带上了15-个2与0载体序列同源性的碱基。M3罗无降位点区1般目的片成取M3罗无降位点区1般目的片成取ICtdHB-infuEicnPCR片段：蹒悭化最粒（曲:g匕j=25:1图1：无缝克隆原理图在用无缝克隆方式进行分子克隆时，主要操作步骤分为以下3点：1线性化目的载体（图左上）：用酶切或是方式1）质粒酶切法在目标载体质粒上选取合适的位点进行单酶切或双酶切，对酶切后的载体进行割胶纯化。）质粒法如果没有合适的酶切位点，你也可以通过方法实现载体的线性化

4、。图法线性化载体示意图。在插入位点两侧设计一对方向相反的引物对载体进行扩增，通过跑胶回收获取线性化载体片段获取目的片段。设计的引物5端需要和线性化载体末端有的重叠（图中蓝色和黄色片段）；图3：目的片段同源的引物设计针对双酶切法线性化载体设计插入片段的引物，其重叠区域为酶切位点，这样重组成功的质粒上会完好保留此两个酶切位点。如果是法线性化载体，扩增插入片段的引物5端直接设计成与线性化载体末端525重叠即可。插入片段的3按照一定比例把二者混合在infusion（无缝克隆试剂盒）的2x预混液内，50反应20in后直接转化即可。反应体系如下：1-3片段4-6片段阳性对照PCR产物+线性化载体质粒XU(G.02-0.5pinols)(0.2-1ptuok)10MlHB-inni$loaMasterMil(2k)1ftpl1O|A1101超纯H；OUpto20国Up20pl通过以上三步，就可以完成质粒重组。只要再进行后续的转化感受态等操作，就可以完成载体构建。当然，这么简单高效的分子克隆方式，怎么能少了小山$1。无缝克隆试剂盒呢！无论你是要做简单的克隆，还是多片段克隆