沙枣花黄酮成分的含量测定及其药理作用的初步研究

1、沙枣花黄酮成分的含量测定及其药理作用的初步研究【摘要】目的参照中国药典(2022版)测定沙枣花(Elaeagnusangustifliablsss，EAB)中总黄酮和芦丁的含量，并初步讨论沙枣花醇提物(thealhlextratfElaeagnusangustifliablsss，AE-EAB)对四氯化碳(l4)诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用。方法参考?中国药典?通过分光光度法和高效液相色谱法测定EAB中总黄酮和芦丁的含量，并通过测定小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)的活性和肝组织匀浆中丙二醛(DA)的含量和超氧化物歧化酶(SD)、谷胱甘肽(GSH)的活性及观察肝脏形态学改变

2、，研究不同剂量AE-EAB对小鼠l4急性肝损伤模型的保护作用。结果测得EAB中总黄酮的含量为27g/g，芦丁的含量为0.029g/g。与l4诱导的肝损伤模型比拟,AE-EAB给药组小鼠血清中ALT,AST活性明显降低(P0.05),同时小鼠肝组织中DA含量明显下降(P0.01),GSH含量有所升高(P0.05),SD活力明显增强(P0.01)。形态学观察,AE-EAB能明显减轻l4对肝组织的损伤。结论EAB含有黄酮类化合物，AE-EAB对l4诱导的小鼠急性肝损伤具有保护作用。【关键词】沙枣花;黄酮;急性肝损伤;四氯化碳Abstrat：bjetiveTdeterinethententsfttal

3、flavnidsandrutininElaeagnusangustifliablsss(EAB)ardingtTehnialStandardFrhinesePharapEia(2022versin),andtstudytheprtetiveeffetsfthealhlextratfElaeagnusangustifliablsss(AE-EAB)nautehepatiinjuryinduedbyarbntetrahlride(l4)inie.ethdsSpetrphtetriethdandhighperfraneliquidhratgraphyereusedtdeterinethentents

4、fttalflavnidsandrutininEAB，ardingtTehnialStandardFrhinesePharapEIa(2022versin).ThelevelsfALT,ASTinseruandDA,SDandGSHinliverereeasuredandthehepatihistlgialhangeserebservedbyptialirspeinrdertstudytheprtetiveeffetsfdifferentdsesfalhlextratfAE-EABnautehepatiinjuryinduedby0.1%l4inie.ResultsThententfttalf

5、lavnidsfEABis27g/g(27gttalflavnidsin1gEAB),andthatfrutinas0.029g/g(0.029grutinin1gEAB).paredithdelgrup,thelevelsfALT,ASTinseruerebviuslydereased(P0.05),andthelevelfDAinliverasalslered(P0.05),buttheativitiesfGSHandSDinlivererearkedlyiprved(P0.05，P0.01)afterpretreatentithAE-EAB.AE-EABaeliratedthehepat

6、ipathlgialhangest.nlusinTheresultsshthatEABntainsflavnids,andAE-EABhasprtetiveeffetsnautehepatiinjuryinduedbyl4inie.Keyrds：EAB;Flavnids;Autehepatiinjury;arbntetrahlride沙枣花为胡颓子科植物沙枣ElaeagnusangustifliaL.的花,主产于西北地区。宁夏沙枣树抗旱耐碱,具有很强的生命力,也是宁夏防风固沙的重要植物。沙枣花呈银白色，下垂，花呈漏斗形，长57。据?中药大辞典?记载,沙枣花主要含山萘酚、花白素、脂肪油和少量挥发

7、油,具有止咳平喘的功能,可用于治疗慢性气管炎1。目前对沙枣花研究较多的是其挥发油成分2。本研究通过分光光度法测定了沙枣花醇提物中总黄酮的含量,结果测得沙枣花中总黄酮的含量为27g/g(即1g沙枣花乙醇提取物中含总黄酮27g);通过高效液相色谱法高效液相测定沙枣花乙醇提取物中芦丁的含量，结果测得沙枣花乙醇提取物中芦丁的含量为0.029g/g(即1g沙枣花乙醇提取物中含芦丁0.029g)，说明沙枣花中含有黄酮类物质。本文还对沙枣花醇提取物浸膏对l4所致小鼠急性肝损伤的保护作用做了初步研究,为进一步开发应用沙枣花提供一些实验根据。1材料与仪器1.2试剂丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AS

8、T)、超氧化物歧化酶(SD)、丙二醛(DA)、谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒(南京建成生物工程研究所);甲醇为色谱纯(天津市江天化工技术),水为超纯水,其它试剂均为分析纯。芦丁标准品(宁夏医科大学药学院提供)。1.3药材沙枣花采自宁夏医学院旁沙枣林，经宁夏区药品检验所中药研究室主任韩文欣鉴定为胡颓子科植物沙枣树ElaeagnusangustifliaL.的新颖花序。1.4仪器高效液相色谱仪(日立DELL-2100/2130);AllSPhereDS18(4.6250)色谱柱;旋转蒸发仪(上海亚荣);SHB-III型循环式多用真空泵(郑州长城科工贸);KQ-3200DE数控超声波清洗器(昆山市超声

9、仪器);ili-Q超纯水仪(法国);电子天平(梅特勒-托利多仪器);721分光光度计(北京瑞利分析仪器公司);高速低温离心机(日立公司F16RX);恒温水浴锅(上海精宏实验设备)。2方法与结果2.1分光光度法测定沙枣花总黄酮的含量32.1.1对照品溶液的制备精细称取在120枯燥至恒重的芦丁对照品50g,置于25l量瓶中,加甲醇适量,置水浴上微热使溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀。精细量取10l,置100l量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得(每毫升中含无水芦丁0.2g)。2.1.2标准曲线的制备精细汲取标准溶液1，2.3，3，4，5，6l置25l量瓶中,各加亚硝酸钠溶液1.00l,混匀,放置显色6in

10、,加10%硝酸铝溶液1l,摇匀，放置6in，加氢氧化钠试液10l,再加水至刻度，摇匀，放置15in，以相应试剂为空白，按照紫外-可见分光光度法在500n波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。其回归方程Y=10.31X-0.0035,相关系数r=0.9985,线性关系良好。2.1.3测定法取本品粗粉1g，精细称定，置索氏提取器中，加石油醚适量，加热回流至提取液无色，放冷，弃去乙醚液。再加甲醇90l，加热回流至提取液无色，转移至100l量瓶中，用甲醇少量洗涤容器，洗液并入同一量瓶，加甲醇至刻度，摇匀。精细量取10l,至100l量瓶中，加水至刻度，摇匀。精细量取3l，置25

11、l量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加亚硝酸钠起依法测定吸光度，测得吸光度值为0.030，从标准曲线上算得供试品溶液中总黄酮的浓度为0.00324g/l，即算得沙枣花中总黄酮的含量为27g/g(即每克沙枣花中含有总黄酮27g)。2.2RP-HPL色谱法测定芦丁的含量32.2.1标准曲线的制备取芦丁对照品溶液(0.1g/l)分别进样,进样体积分别为1，2，4，6，8，10，35，40l,测定峰面积,以进样量为横坐标,峰面积A为纵坐标,得回归方程为A=6.9109+191498,相关系数为r=0.9998,芦丁在0.386.08g范围内成良好的线性关系。见图1。2.2.2色谱条件色谱柱为DS1

12、8(4.6250),检测波长360n,柱温为室温(30),流速1.0l/in,流动相为甲醇-水-冰醋酸(3562.42.6)。2.2.3供试品溶液制备及芦丁的含量测定取沙枣花粗粉1g，精细称定，置具塞锥形瓶中，精细参加甲醇50l，称定重量，超声处理(功率250，频率25kHz)30in，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，滤过。精细量取滤液5l，置25l量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。用0.45微孔滤膜过滤,进样10l按“2.1.1项下色谱条件注入色谱仪,测峰面积。结果测得沙枣花乙醇提取物中芦丁的含量为0.029g/g(即每克沙枣花乙醇提取物中含芦丁0.029g)。见图2。

13、2.2.4沙枣花醇提物浸膏的制备1.0kg沙枣花切碎后,加3倍量80%乙醇加热回流提取(1h3),合并滤液,减压浓缩,得121.3g沙枣花浸膏。2.2.5沙枣花浸膏最大给药剂量的测定4安康昆明种小鼠40只，1822g，雌雄各半，分两组，沙枣花醇提物灌胃，0.4l/只(最大容积，最大耐受量)，给药前禁食10h，正常饲水。观察14d，记录小鼠一般状况改变及死亡数。结果发现，给药后1020in呼吸加快，1h后呼吸平稳。观察1周未见小鼠外观及行为有任何变化，未见小鼠死亡。因此灌胃最大耐受量为16.0g/kg。转贴于论文联盟.ll.2.2.6l4诱导的小鼠急性肝损伤模型的建立4昆明种小鼠60只,雌雄各半

14、,将小鼠随机分成6组,每组10只。分别为正常对照组，l4模型组，阳性药(联苯双酯滴丸)对照组(0.2gkg-1)、沙枣花浸膏高(16gkg-1)，中(8gkg-1)，低(4gkg-1)剂量组,灌胃给药21d,同时模型组和正常对照组分别给予同体积生理盐水。于第21天给药2h后,每鼠ip10lkg-1,0.1%l4橄榄油溶液,正常对照组给等量的橄榄油溶液，禁食,不禁水。造模16h后,眼球取血,血液3000rin-1离心10in,取血清超低温冰箱-80冻存以备下一步检测所需。采血后,快速断头处死，取肝右叶组织0.5g,在冰生理盐水中漂洗,滤纸拭干,用生理盐水制成10%肝组织匀浆,离心,取上清液待测。

15、同时取左叶肝脏,4%多聚甲醛固定作病理切片。测定指标：血清ALT、AST,按试剂盒要求进展测定;肝组织匀浆SD、DA和GSH,按试剂盒要求进展测定;取肝左叶同一部位组织,用常规石蜡包埋,切片,HE染色,光镜下观察肝组织的形态学变化。统计学处理：采用SPSS12.0统计软件，数据以s表示。组间采用t检验，P0.05为差异有统计学意义。2.3血清生化指标检测结果说明,皮下注射l4可引起小鼠急性肝损伤,表如今血清中ALT,AST活性明显升高。AE-EAB各剂量组均可使其升高的ALT,AST活性显著降低(P0.05或P0.01),提示AE-EAB对l4引起的小鼠急性肝损伤有很好的保护作用。见表1。表1

16、AE-EAB对急性肝损伤小鼠血清ALT,AST的影响与正常对照组比拟,*P0.05，*P0.01;与模型对照组比拟,P0.05,P0.01;n=102.4肝组织匀浆生化指标检测从实验结果可见,模型组小鼠肝组织中DA含量明显升高(P0.01),SD与GSH活性显著下降(P0.01),提示肝脏出现脂质过氧化。而AE-EAB各剂量组均可显著抑制肝组织中DA的升高,而SD,GSH活性明显升高(P0.01或P0.05),提示AE-EAB有较强的抗氧化及去除氧自由基的作用。结果见表2。表2AE-EAB对急性肝损伤小鼠肝组织SD,DA和GSH的影响与正常对照组比拟,*P0.05，*P0.01;与模型对照组比

17、拟,P0.05,P0.012.5肝脏组织病理学观察正常对照组小鼠肝脏外观呈红褐色,质地软而富有弹性;在光镜下可以观察到肝小叶构造完好,细胞排列整齐,大小均匀,分界清楚，无炎细胞浸润(图3-A)。模型组小鼠肝脏体积增大,质脆,边缘钝而厚,外表呈黄褐色，有暗红色出血点;镜下见肝小叶构造破坏,肝细胞核消失，出现以中央静脉为中心的局灶性肝细胞变性、坏死和大量炎细胞浸润(图3-B)。联苯双酯组(图3-F)和AE-EAB(图3-E)高剂量组肝脏略有水肿,质地柔软;镜下见肝小叶构造根本完好,细胞排列较整齐,只有少量的炎细胞浸润,较模型组有明显改善。AE-EAB(图3-D)中剂量与低剂量组(图3-)与模型组相

18、比变化不明显(图1)。3讨论肝炎是一种发病率高,难以根治的疾病,对人类安康危害极大,而且不良的饮食习惯、外界环境等均能导致肝脏疾病,损害肝细胞。在肝细胞病变过程中,自由基、酶及脂质过氧化等均发挥重要作用5，l4是诱导化学性肝损伤的常用药物,在体内经肝脏细胞色素P450激活生成三氯甲基自由基(l3)二氯甲烷自由基(l2)等,引起膜的脂质过氧化,使肝细胞膜通透性增加,引起肝细胞严重受损,细胞内转氨酶易穿过细胞膜而释放入血液6。DA是脂质过氧化降解的主要产物,其含量反映了组织脂质过氧化损伤程度的大校SD和GSH是细胞内主要的抗氧化酶类,可去除机体内过多的自由基,激活或调动机体中的内源性抗氧化系统,预

19、防或减轻自由基损伤。DA的测定常常与SD的测定互相配合,SD活力的上下间接反映了机体去除氧自由基的才能,而DA的上下又间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度7，8,GSH广泛存在于人体的各种组织中，GSH程度降低意味着机体抗氧化才能下降并引发机体的氧化应激反响,产生大量的自由基。在肝脏化学性损伤时,氧化应激消耗GSH引起肝组织中GSH含量下降,机体抗氧化才能下降并引发机体的氧化应激反响9。大量实验说明10：各种黄酮类化合物如黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮类、异黄酮类、黄烷酮类等对化学性肝损伤、药物性肝损伤、免疫性肝损伤、酒精性肝损伤、缺血/再灌注性肝损伤等实验性肝损伤均有不同程度的保护作用，这种

20、保护作用与黄酮化合物去除自由基、抗氧化、抗脂质过氧化反响、调节免疫功能等有关，本实验结果说明,沙枣花醇提物能降低l4诱导的急性肝损伤小鼠血清中ALT和AST的程度,减轻肝细胞的炎性浸润和变性坏死等病理改变,同时还明显降低肝组织中DA的含量,并进步SD和GSH的活力。降低机体内自由基的含量，进步机体的抗氧化才能。我们也对沙枣花醇提物做了总黄酮的测定，并用高效液相色谱法分析了沙枣花醇提物中芦丁的含量，发现沙枣花中含有黄酮类化合物。综上所述,沙枣花醇提物可以抑制自由基诱导的肝脏脂质过氧化损伤作用,进步机体去除氧自由基才能,维持细胞膜构造和功能的完好性,从而对l4诱导的化学性肝损伤起一定的保护作用，但到底是不是沙枣花中的黄酮类物质对实验性肝损伤起保护作用以及其作用机制还有待进一步研究。【参考文献】1南京中医药大学.中药大辞典，第2版，上册.上海：上海科学技术出版社，2022：1630.2王妍，李玲，连松刚，等.顶空-固相微萃取气质联用分析宁夏沙枣花中香气成分J.中草药，2022,38(11):1627.3国家药典委员会.中国药典，I部S.北京：化学工业出版社，2022.4