菌体细胞裂解法汇总

1、1、将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓 度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。2、至少3次以上冻溶。3、IFCC推荐法：收集细胞悬液，4C低温离心(3000rpm，5min)，弃上清，加入一定量PBS (200ul)，轻轻吹 打混匀，-200C冷冻30 min，370C解冻，如此反复3次，可形成细胞裂解液。4、用液氮冻融三四次就可以了，细胞冻住后，取出放37度水浴，溶解后震荡，再冻二、超声波处理法1、要设定好超声时间和间隙时间，一般超声时间不超过5秒，间隙时间最好大于超声时间，这 些都有利于保护酶的活性。我的实验超声时间5秒、间隙时间10秒、工作次数2

2、0次。2、每个样本超声时间5秒，每个间隔5秒，粉碎5次。3、100ml菌液离心，用8ml缓冲液悬浮，加8mg溶菌酶，冰浴30min，然后超声处理。750W40% 功率。5秒超声，9秒间隔。超声至少90min。4、综合冻融和超声的方法：1500g离心，弃除上清。冰上，用小体积PBS重悬细胞。将重悬液集中，1500g离心浓缩，弃除上清。液氮骤冷。用约5倍体积的PBS缓冲液重悬细胞， 并搅拌。可选择：4C下超声破碎细胞。加入终浓度为0.25M的KCl，15mM的DTT4C下111500gX60min 离心裂解液。取出上清。过柱子。Purification of GST-Fusion Proteins

3、 from E. coli-Alternate Protocol三、渗透法：冰冷的 20 mmol/L Tris-Cl (pH8.0)，2.5 mmol/L EDTA 处理，冰浴放置 10min。精编分子生物学实验指南四、裂解液处理法：1、细胞裂解液：50 mmol/L Tris-Cl pH 6.8，100 mmol/L DTT，2% SDS，0.1%漠酚蓝，10%甘油。 SDS是阴离子型表面活性剂、极易促溶、强变性作用。2、在loading buffer加SDS，100度5分钟，是变性方法。SDS与蛋白等量结合，可以通过条 带位移判断蛋白大小，考染不会影响结果。3、如果是做小量菌液，跑PAG

4、E胶看其表达情况的话，可以直接加蛋白loading buffer煮沸5 分钟即可，需注意的是上样前要离心12000rpm至少5分钟，然后上样时，枪头别吸最底下的。4、20 毫升细胞裂解液配方:40 L 0.5M EDTA (PH8.0)，4 ml 10% SDS，1 ml 1M Tris-cl(PH6.8)，14.96 ml蒸馏水。5、我始终未明白楼主如果想收集全蛋白，而不考虑包涵体的话，为何要用超声呢？直接水煮不 就可以了吗？6、将1ml菌离心弃上清，留大概50ul，再加50ul 2X上样缓冲液，煮10min，取20ul上样， 就可以了。7、检测蛋白诱导：从培养的不同时期各取出1ml，120

5、00gX1min离心。将沉淀重悬于100ul 1XSDS上样缓冲液（50mM Tris-Cl （pH6.8），100mM DTT，2%SDS，0.1%漠酚蓝，10%甘油）中，100C加热 3min，然后 12000gX1min 离心。上样 15ul，6%SDS电泳。分子克隆P8268、5-10秒离心，弃除上清，用50ul蒸馏水重悬沉淀。加入1ul PMSF，再加入50ul热的2XSDS 上样缓冲液（100C加热）。迅速混匀后100C加热3-5min。将样品冰上放置（或-20C放置）， 然后再溶解，煮沸1min。离心30秒。上样5ul进行SDS电泳。2XSDS 上样缓冲液：250mMTris-C

6、l，6.2%（w/v） DTT，8%SDS，0.002%（w/v）漠酚蓝，40% 甘油。Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli。9、裂解液：50mMTris-HCl（pH8.59.0），2mMEDTA，100mMNaCl，0.5%TritonX-100，1mg/ml 溶菌 酶。10、我们用NP40 （NP40： NONIDET p-40乙基苯基聚乙二醇，是一种非离子表面活性剂。）加DTT 和蛋白酶抑制剂裂解细胞，冰上放30 60min，然后13000rpm离心15min，取上清定量。11、 裂解液配方是:50mmol/L Tirs-HC

7、I （PH 8.0），150mmol/L NaCI，0. 02% 叠氮钠，100口 g/ml PMSF，川 g/ml Aprotinin， 1% Triton X-100 （ or NP-40）。12、对于组织培养中生长的细胞，最有效的裂解方法是用去污剂（表面活性剂）进行处理，溶解 细胞膜并溶解蛋白质。50mmol/L Tirs-HCl（PH 8.0）、150mmol/L NaCl、0. 02% 叠氮钠、100口 g/ml PMSF、1 口 g/ml Aprotinin、1% Triton X-100 （ or NP-40），这种裂解液可能是最常用的裂解 缓冲液。13、 细胞裂解液的主要目的：

8、（1）利用去污剂破坏脂质双分子层，破裂细胞；（2）溶解蛋白； （3）蛋白变性使其稳定；（4）抑制蛋白酶活性。推荐 RIPA buffer:50 mM Tris-HCl pH 7.4 （缓冲体系），150 mM NaCl （等渗体系），1 mM PMSF （强大的蛋白酶抑制剂），1mMEDTA （变性剂和稳定剂），5 Mg/ml Aprotinin （蛋白酶抑制剂），5 Pg/ml Leupeptin（蛋白酶抑制剂），1% Triton x-100 （破坏细胞），1% Sodium deoxycholate （中度变性剂和蛋白溶解剂），0.1% SDS （强变性剂和蛋白溶解剂）。14、裂解 bu

9、ffer： 50mM HEPES pH7.0，1mM 甘油，1mM DTT （还原剂），7M 尿素，2M 硫脲（可以 提高膜蛋白的融解），1mM EDTA（金属鏊合剂），1mM PMSF，1mg/ml leupeptin，1mg/ml aprotinin， 1mg/ml pepstatin（蛋白酶抑制剂），50mM NaF（ph7.0） （anti hemoaggulating），1mM Na3VO4（ph7.0）（inhibitor of phosphatases） ， 2mM benzamidine （inhibitor of trypsin）。15、可选择：取0.5ml诱导的细胞并离心2

10、min。弃除上清，用100ul 1XSDS上样缓冲液重悬， 冰上放置。6000rpmX10min离心培养物。弃除上清，用10ml预冷的裂解液重悬沉淀。液氮骤冷细胞或-20C 冷冻细胞。在冷水中溶解细胞。15秒、4次超声处理细胞。冰浴降温4C, 9000gX30min离心。 取上清。裂解液：5 mM DTT, 15 mM KCl, 5 mM MgCl2, 50 mM HEPES, pH 7.9, 1 mM EDTA, 10 mg/ml 溶 菌酶（临用前加上DTT和溶菌酶）。Purification of GST-Fusion Proteins from E. coli-Basic Protocol16、收集细胞。在液氮中突然冷冻细胞