兔瘟组织灭活苗制作

1、关于兔瘟组织灭活苗的制作第1页，共28页，2022年，5月20日，9点52分，星期四流行病学诊断 临床诊断 病理诊断第2页，共28页，2022年，5月20日，9点52分，星期四 微生物(Microorganism) 形体微小、结构简单，须借助于光学显微镜或电子显微镜进行观察。 病毒(包括噬菌体)； 细菌、放线菌、立克次氏体、支原体、衣原体、螺旋体等； 真菌：包括酵母菌（单细胞）、霉菌（多细胞）； 单细胞的藻类以及原生动物等。非细胞型微生物单细胞原核微生物真核微生物第3页，共28页，2022年，5月20日，9点52分，星期四 细菌(bacteria)的细胞形态 1、球菌 单独存在时为圆球形，几个

2、细菌联在一起时其接触面稍为扁平。按其分裂方向和分裂后排列状态，可以分为：单球菌、双球菌、四联球菌、八叠球菌、链球菌、葡萄球菌。2、杆菌 细胞呈杆状或圆柱状，各种杆菌的长度与直径比例差异很大，有的粗短，有的细长，短杆菌近似球状，长杆菌近似丝状。一般来说，同一种杆菌其粗细比较稳定，而长度则经常因培养时间、培养条件不同而有较大变化。有的杆菌很直，有的稍弯，有的两端截平如炭疽芽孢杆菌，有的略尖，有的半圆。 第4页，共28页，2022年，5月20日，9点52分，星期四 （三）革兰氏染色 革兰氏染色法于1884年由丹麦医生Gram创立，是延用至今的经典染色法。 经革兰氏染色后可以把全部细菌分为G+和G-两

3、大类。 染色机制：与细菌细胞壁的结构和组成有很大关系。 G+细菌：肽聚糖层厚，含量多，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色，复染后不着色，保持结晶紫的颜色； G-细菌：肽聚糖层很薄，含量少，脂肪含量高，经乙醇处理后部分细胞壁脂类可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径变大或通透性增加，不能阻止溶剂透入，酒精将结晶紫与碘的复合物洗脱，细菌被脱色，经复染后染成红色。 第5页，共28页，2022年，5月20日，9点52分，星期四细胞壁革兰氏阳性菌 (G+)革兰氏阴性菌 (G-)厚度与强度厚、致密、坚韧薄、疏松肽聚糖数量、含量多层、含量高、占细胞干重4090

4、%单层、含量低、占细胞干重510%脂类含量少、占细胞干重1-4%多、占细胞干重11-22%磷壁酸（垣酸）+-脂多糖、磷脂、脂蛋白-+肽聚糖脂蛋白磷壁酸外膜第6页，共28页，2022年，5月20日，9点52分，星期四染色操作步骤涂片固定滴生理盐水挑取菌苔一环涂片热固定干燥取菌液一环涂片干燥第7页，共28页，2022年，5月20日，9点52分，星期四革兰氏染色法1. 涂片、干燥及固定2. 初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1-2分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。3. 媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。4. 脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约25秒

5、，后立即用流水冲洗。5. 复染：滴加番红染色液，染2分钟，水洗后用吸水纸吸干。 6. 镜检：观察染色结果图。第8页，共28页，2022年，5月20日，9点52分，星期四细水冲洗结晶紫初染2min碘液媒染1min95%酒精脱色 20s蕃红复染 12min细水冲洗细水冲洗第9页，共28页，2022年，5月20日，9点52分，星期四 革兰氏染色成败关键： 酒精脱色，脱色不够将G-转变为G+，脱色过度将G+变成G-； 涂片要均匀、薄； 菌龄影响染色，菌龄老、陈旧的细菌培养物，往往G+转变成G-，一般做革兰氏染色用18小时左右的细菌培养物，不要超过24小时，以免影响染色性。第10页，共28页，2022年

6、，5月20日，9点52分，星期四油镜操作规程1. 先用低倍镜和高倍镜观察涂片，待看到目的物后，将其移到视野中央。2. 在涂片上滴一滴香柏油，转动换转器使油镜针对通光孔。3. 使油镜与香柏油接触，这时油镜头几乎与载玻片相接触，切记不能使用粗调，以免压碎载玻片。4. 用细调旋钮慢慢提升镜头高度，直至物像清晰。切勿拧反方向。5. 观察完毕后，使镜筒远离载物台。取下载玻片。用擦镜纸擦去镜头上的香柏油：先用干的擦镜纸擦12次，把大部分油去掉，再用二甲苯滴湿的擦镜纸擦2次，最后再用干擦镜纸擦1次。擦拭时要顺镜头的直径方向，不要沿镜头的圆周擦。擦拭要细心，动作要轻 。 第11页，共28页，2022年，5月2

7、0日，9点52分，星期四五、结果： 绘模式种、自选种镜检油镜视野图（比例、形状准确，注放大倍数，染色特性）G+ (金黄色葡萄球菌)G-（枯草芽孢杆菌）G-（大肠杆菌）第12页，共28页，2022年，5月20日，9点52分，星期四Gram Stain of Staphylococcus aureusGram Stain of Escherichia coliA Gram Stain of a Mixture of Gram-Positive and Gram-Negative Bacteria.第13页，共28页，2022年，5月20日，9点52分，星期四 兔病毒性出血症的诊断及其组织灭活苗的制

8、造王海荣第14页，共28页，2022年，5月20日，9点52分，星期四 兔的病毒性出血症（rabbit viral hemorrhagic diseaze）是兔的一种急性败血性传染病，RHDV抗原性强，组织灭活苗效果极佳，安全可靠，目前广泛使用的是肝组织甲醛灭活苗，联苗兔瘟、巴氏杆菌二联苗也已使用。第15页，共28页，2022年，5月20日，9点52分，星期四 组织灭活苗可分加佐剂和不加佐剂两种。含佐剂苗所产生的抗体水平较高于无佐剂苗，但产生免疫力的时间迟于无佐剂苗，而且生产程序较为复杂，成本也高。 当发生免瘟时，作为紧急接种，选用无佐剂苗更为理想，因产生免疫力较快，可提早控制疫情，即使平时预

9、防接种，无佐剂苗也极为有效。第16页，共28页，2022年，5月20日，9点52分，星期四一 材料 （1）种毒 强毒株组织毒1:10悬液感染成兔肌注1ml，4872小时引起发病死亡。（2）制苗动物 3月龄以上未感染本病和未接种本病疫苗的健康免。 组织捣碎机等第17页，共28页，2022年，5月20日，9点52分，星期四二、操作方法1、攻毒取种毒2-5g制成1:10组织悬液，每毫升各加青链霉素1000IU单位,在4处理46小时，取上清液皮下或肌肉注射兔子，1ml/只，实验免接毒后的观察。第18页，共28页，2022年，5月20日，9点52分，星期四（1）抗生素可先配制成高浓度的原液， -20保存

10、。（2）抗生素的最高使用浓度。 青霉素钾1万单位/ml 链霉毒钾：20mg/ml即 1mg=1000Iu 2万Iu/ml。 抗生素的配置： 1先配浓溶液20万/ml，25万/ml第19页，共28页，2022年，5月20日，9点52分，星期四2、RHD的临床诊断及实验室诊断临床上，RHD以神经症状为主，在免疫压力可表现出非典型变化。剖检以呼吸系统的严重出血和内脏实质器官的淤血肿大为特征。人工感染后的发病高峰时间 接种后3672小时。第20页，共28页，2022年，5月20日，9点52分，星期四RHDV可凝集人的O型红细胞，温度对血凝无显著影响，PH4.4-7.2时血凝稳定，血凝具有特异性，能被高

11、免血清所抑制。 第21页，共28页，2022年，5月20日，9点52分，星期四 10%肝悬液4000rpm，10-15分钟离心后取上清，1%人O型红细胞做HA，放置20-30分钟出结果，血凝现象的观察时间不超过45分钟。 HA1160即为阳性 阳性病料无论是自然死亡还是人工感染致死，其血凝价一般不低于25。 健康兔只有2223，24。第22页，共28页，2022年，5月20日，9点52分，星期四RHD组织灭活苗的制造与检验 病料：PBS=1:10，生理盐水也可。捣碎、滤过，加入甲醛，使之含0.4%，371224小时，摇匀/2小时。 用0.8%甲醛生理盐水对倍稀释，分装，37温箱内灭活48小时，每2小时摇匀一次，备检。第23页，共28页，2022年，5月20日，9点52分，星期四方 法： 100g+400ml灭菌生理盐水高 速组织、捣碎碎机匀浆（13）过滤用0.8%甲醛生理盐水对倍稀释分装37温箱内灭活24小时，每2小时摇匀一次，备检。第24页，共28页，2022年，5月20日，9点52分，星期四检验： 安全检验：23倍接种量1ml3ml(血液琼脂斜面，厌氧肉肝汤) 无菌检验：培养基接种。 效力检验：第25页，共28页，2022年，5月20日，9点52分