“从RNA提取到荧光定量PCR”的解决方案课件

1、 神经生物学科研中心 分子生物学平台 张宝乐“从RNA提取到荧光定量PCR”的解决方案一、RNA提取及反转录样品收集 提取RNA 的样品要保证“新鲜” （屠宰后，立即放入液氮，过夜后转入-80冰箱）RNA提取 防止RNA酶的污染：DEPC处理 150-180 烘烤3-4hTrizol-氯仿（氯仿-异戊醇49:1）-异丙醇-75%乙醇试剂盒（离心柱滤膜吸附法）提取方法：RNA 检测 甲醛变性电泳: 三条带（28、18、5.8/5S） 紫外吸光值检测： OD260/280 (1.8-2.0) （1.7蛋白质或酚污染；2.1异硫氰酸残存或降解） OD260读数（0.1-0.5） (线性关系好) RN

2、A得率=OD260*稀释倍数*40ng/l反转录 模版： 总RNA、mRNA、体外转录的RNA 引物: oligo（dT）、随机引物、基因特异引物(GSP)利用普通PCR初筛定量引物 特异性、避免产生引物二聚体 产物长度90-300bp之间 退火温度：60左右（内参和目的基因一致） 考虑目标剪接体（若基因存在可变剪切） 尽量跨内含子设计引物Real-time PCR 检测 确定引物的有效性（扩增曲线、熔解曲线、标准曲线）二、 Real-time PCR 荧光定量PCR原理常用名词概念扩增曲线荧光阈值Ct值荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一

3、般荧光域值的设置是 基线（背景）荧光信号的标准偏差的 10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（ threshold value ）。 NOTE: 采用 72延伸时采集荧光!95 60 左右NOTE:质粒获得后，用限制性内切酶单酶切，使其线性化！或者使用纯化的PCR产物。NOTE: 稀释液可采用专用的定量PCR稀释液，如EASY DILUTION标准曲线的线性关系不佳可能的原因： 1.加样存在误差，标准品稀释不呈梯度； 2.标准品降解：标准品尽量避免反复冻融； 3.引物或探针不佳：重新设计； 4.模板中存在抑制物，或模板浓度过高。PCR过程中经常出现的几个

4、问题分析Ct值出现过晚（30）：阈值设计过高；反应条件不佳：未最佳反应条件，可重新设计引物或探针，适当降低退火温度，增加镁离子浓度等； PCR各种反应成分的降解或加样量不够； 扩增产物片段过长：一般采用 100200bp 的扩增长度。阴性对照出现明显的扩增： 荧光 PCR mix 或水被污染； 气溶胶的干扰； 引物二聚体的出现：在 35 循环后阴性对照出现扩增属正常情况，可配合溶解曲线进行分析。PCR结果的重复性不好： 加样不准确； 仪器在样品上温度条件有差异，温度均一性不好； 模板浓度低：样品初始浓度越低，重复性越差，应减少样品的稀释倍数。扩增效率低： 反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解； 反应条件不佳：适当降低退火温度或改为三步扩增法； 反应体系中有抑制物：一般为模板中引入，应先把模板适当稀释，再加入到体系中，减少抑制物的影响。荧光定量PCR Ct值一般在多少后认为模板没扩增： 当进入对数期的循环数大于35时，Real time RT-PCR检测无效，基因没有表