荧光定量PCR原理和应用-LQ课件

1、实时荧光定量PCR原理及应用刘倩December,2004实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。实时定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取出PCR产物进行分离。目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域。实时荧光定量PCR原理实时荧光

2、定量PCR的方法应用实时荧光定量PCR的实验要素及 注意事项OUTLINE实时荧光定量PCR原理 什么是实时荧光定量PCR荧光检测原理三步循环：高温变性，低温退火，中温延伸94 3min94 10sec60 15sec72 20secGo to 2 for 29 cycles 72 5min4 forever指数扩增PCR（polymerase chain reaction）指数期平台期反应体系中加入荧光物质荧光强度随着PCR扩增产物的积累成比例变化通过检测荧光信号对PCR反应进行实时定量监测Opticon实时定量PCR实时定量PCR与普通PCR的区别普通PCR技术： 在PCR结束后对终点产物

3、进行定量分析。实时定量PCR技术：实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。实时荧光定量PCR如何对起始模板定量？引入两个概念：荧光阈值：在荧光扩增曲线指数增长的初期设定的一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准)循环阈值 (Ct值)：PCR扩增过程中，扩增产物量(荧光强度）到达阈值时所经过的循环次数18.12 +/-0.04荧光域值线 C(t) 值 18.12 +/-0.04-0.04C(t) 值-0.04指数期平台期初始 DNA量越多, 荧光达到某一值（荧光域值）时所需要的循环数越少(Ct值越小) DNA浓度每增加1倍， Ct值减少1个循环Log浓度与Ct值呈线性关系，根据C

4、t值就可计算出样品中所含的模板量确定初始模板的浓度公式推导:只适用于PCR指数扩增期：理想的PCR反应：X=X0*2n实际的PCR反应: X=X0 (1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率设立标准曲线：设定阈值线，得到每条扩增曲线的Ct值，软件自动利用标准品的起始浓度和Ct值作出标准曲线。 .未知荧光强度-循环数曲线初始模板量对数-C(T)值标准曲线10410310610510210通过未知样品的Ct值,从标准曲线上计算出该样品的起始浓度unknown104103Unknown contains 3108 copies荧光染料类 SYBR Gr

5、een I荧光探针类 Molecular Beacon （分子信标） TaqMan实时荧光定量PCR原理 荧光检测原理SYBR Green 1 结合到双链DNA的小沟部位SYBR Green 1 染料结合到双链DNA后荧光信号增强1000倍。SYBR Green I使用方便 - 不必设计复杂的荧光探针 没有序列特异性 - 可以用于不同的模板 便宜 灵敏SYBR Green I对引物特异性要求较高与非特异性产物结合， 因此必须在反应结束后 做熔解曲线分析SYBR Green I 缺点熔解曲线分析通过产物的Tm值来确定产物-可区分单一产物、变异产物、多种产物、引物二聚体SYBR Green IMo

6、lecular BeaconsMolecular Beacons发夹型杂交探针RQ 荧光淬灭:不发光 展开:发出荧光Molecular Beacons环形结构与目的片断结合比茎部自身的相互配对更稳定TACCGGGGGTTACGAACGGTAATTTTTGCCCCCAAAAQRTarget退火时探针与目的片段结合报告与淬灭基团分离产生特异性荧光Molecular Beacons设计困难 既要避免产生强的背景信号，又要避免茎部杂交过强，影响其与模板的退火，从而影响荧光的生成 只能用于一个特定的目标价格较高Molecular Beacons缺点TaqMan 探针TaqMan水解型杂交探针目标特异性探

7、针5 为荧光基团， 3 为淬灭基团5 荧光报告基团3淬灭基团与目标序列互补TaqMan 探针探针完整时，R发射的荧光能量被Q吸收，无荧光Taq酶有5-3外切酶活性，可以水解探针RQ报告基团淬灭基团RQ报告基团被淬灭FRRQ在PCR进行中，探针与目的序列杂交RQ探针在延伸阶段部分解离RQ探针被DNA聚合酶的 5端外切酶活性水解RQ解离的报告基团发出荧光 每产生一条DNA链，就切断一条探针每切断一条探针，就产生一个单位信号信号强度与结合探针的DNA分子数成正比TaqMan 探针对目标序列有很高的特异性 -特别适合于SNP检测与 Molecular Beacons 相比引物设计 相对简单可以在一个反

8、应中进行多个基因的定量重复性比较好TaqMan 探针价格较高只适合于一个特定的目标背景高TaqMan 探针化学试剂工作原理有否淬灭剂信号检测主要应用范围SYBR Green I结合于双链DNA的小沟中否延伸后熔解曲线分析定量和检测目标基因Molecular Beacons发夹型杂交探针是复性SNP分析定量和检测目标基因TaqMan探针水解型杂交探针（5-3外切）是任何步骤SNP分析定量和检测目标基因OUTLINE实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR的方法应用实时荧光定量PCR的实验要素和 注意事项实时荧光定量PCR应用定量：DNA定量RNA定量定性：点突变分析SNP分析基因型分析DNA甲基

9、化分析熔解曲线分析内源基因拷贝数的鉴定转基因拷贝数的检测DNA定量拷贝数研究（替代Southern Blot）实时荧光定量PCR应用RNA定量基因表达差异（替代Northern Blot)不同组织器官、不同时期、不同处理单个或多个基因地表达谱分析绝对定量与相对定量 相对定量：在被测样本中靶序列相对于参照样本的量的变化差异表达分析芯片评估转基因成分含量检测绝对定量：精确计算样本中靶序列浓度（DNA，RNA），即通常所说的拷贝数病毒DNA或RNA的拷贝数转基因的拷贝数绝对定量 通过标准样品定量 绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒DNA，做系列稀释。标准样品的种类：含有和待测样品相同扩增片段的克

10、隆质粒含有和待测样品相同扩增片段的cDNAPCR的产物相对定量的目的比较靶序列在不同样本中的量的差异（倍数关系）如何实现准确的相对定量？-解决模板提取过程中造成的差别-解决加样过程中的差别如何保证不同样品（RNA或DNA）上样量的一致?相对定量 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响较小内标数量代表样本中所含细胞或基因组数量对样品量校正：目的基因数量/内标基因内标通常选用beta-actin、GAPDH基因、18s rRNA 等看家基因相对定量通过 内标基因定量2-c(t) 法双标准曲线法相对定量方法:2-c(t) 法公式推导M:目标基因，N：内标基因XC(t)M=X0M*2

11、C(t)M=A(域值) (1)XC(t)N=X0N*2C(t)N=A(域值) (2)均一化 (1)/(2):X0M/X0N=2 C(t)N- C(t)M=2-C(t)X0M1/X0N1=2-C(t)1 处理1X0M2/X0N2=2-C(t)2 处理2处理2与处理1相比：(X0M2/X0N2): (X0M1/X0N1)= 2-C(t)2-C(t)1= 2-C(t)C(t)=(C(t)M2-C(t)N2)-(C(t)M1-C(t)N1)理想PCR反应每增加一个循环产物增加一倍N个循环2n倍两个样品，C(t)值每相差1初始模板相差一倍相差N，初始模板相差2n倍比较两个样品差异的简单方法： 2 C(t

12、)2-c(t) 法目标基因内标基因C(t)样本1C(t)M1C(t)N1C(t)1样本2C(t)M2C(t)N2C(t)2C(t)C(t)值与起始模板浓度成反比：2C(t)当有多个样品时（如时间点），各样品均一化后都与同一时间点相比2-c(t) 法适用范围不要求很高的精度（预实验）扩增效率较高，并且目标基因和内标基因扩增效率一致不做标准曲线，高通量检测（芯片评估）2-c(t) 法问题与解决前提：目标基因与内标基因扩增效率一致如何判断？-检测目标基因与内标基因在不同稀释浓度下的C(t)以稀释倍数的对数值对C(t)作图，当直线的斜率近似于0时，说明目标基因与内标基因扩增效率一致。2-c(t) 法问

13、题与解决如何保证扩增效率一致？扩增产物长度：75-300bp内标和目标基因地扩增长度要接近引物设计，特异，退火温度一致模板纯度、复杂度等反应条件优化2-c(t) 法双标准曲线法用目标基因和内标基因的标准品分别获得标准曲线参照与被测样品同时扩增目标基因和内标基因，获得C(t)值通过标准曲线计算目标基因和内标基因的绝对拷贝数用内标基因对目标基因均一化均一化之后的目标基因值相比得出处理与未处理的样本中目标基因的表达差异适用范围需要很精确的结果计算扩增效率较低目标基因与内标基因扩增效率差异较大双标准曲线法利用TaqMan技术研究ERBB2 在乳腺肿瘤组织标本中的表达差异-双标准曲线法已知在50%的乳腺

14、肿瘤样本中，ERBB2表达异常，因此可以作为一个检测标准选用GAPDH作为内标基因FAM标记的ERBB2探针VIC标记的GAPDH探针标准品（质粒）构造标准曲线多重PCR反应阴性对照无RNA对照（空白）无逆转录酶对照（监控基因组污染）实验1组分储存浓度 体积 终浓度 总RNA 1ng/l 2 l ERBB2引物探针混合液 200.5 l 0.5GAPDH引物探针混合液200.5 l 0.5QuantiTect Probe RT-PCR Master Mix 210 l QuantiTect RT Mix 0.2 l ddH2O 6.8 l 终体积 20 l 多重RT-qPCR反应体系实验1RT

15、-qPCR反应程序50 30min95 15min94 15sec60 1minPlate readGo to step 3, 39 more times10 forever实验1标准曲线Color 2 - VIC detection for GAPDHColor 1 FAM detection for ERBB2实验1样品扩增：正常vs肿瘤PMT1-FAM detection- ERBB2PMT2-VIC detection- GAPDH肿瘤肿瘤正常正常实验1实验结果Multiplex Reactions: C(t)Healthy RNACarcinoma28.4027.3628.4627.

16、1228.43 0.0427.24 0.17ERBB2表达Multiplex Reactions: C(t)Healthy RNACarcinoma23.2722.8123.4122.8623.34 0.1022.83 0.03GAPDH表达实验1HealthyRNATumorRNAGAPDHERBB210951052213024929550085730136000130800Copies ng/ l Total RNAERBB2 copies / GAPDH copies1095 / 95500 = 0.0111052 / 85730 = 0.0122130/136000 = 0.01724

17、92/130800 = 0.0197Healthy RNATumor RNA0.0110.0180.018/ 0.0111.63HealthyTissueCarc.TissueRelative Expression00.20.40.60.811.21.41.61.82实验结果实验12-c(t) 法C(t)=4.41-5.18=-0.770.182-c(t) =1.511.93结果与双标准曲线法相近Healthy RNABBER2GAPDHC(t)28.4023.275.3128.4623.415.0528.43 0.0423.34 0.105.180.18Carcinoma RNABBER2G

18、APDHC(t)27.3622.814.5527.1222.864.2627.24 0.1722.83 0.034.41 0.21实验1定性分析：点突变分析等位基因型分析DNA甲基化分析SNP分析熔解曲线分析FRFQGVQTCSNP G/AFQGVQTForward primerReverse primerAllele-specific probeAllele-specific probe点突变分析双Taqman探针法实验2两条探针分别针对不同等位基因SNP placed in the center of the probe Quencher; TAMRA or MGB/NFQ*wtmutGC

19、CT点突变分析双Taqman探针法实验2TGAA双Taqman探针法检测野生型和突变型杂合体个体的DNA扩增产物则可同时与VIC和FAM标记的探针结合同型突变型个体的扩增DNA只与VIC或FAM标记的探针结合野生型 (纯合子) 突变型(纯合子) 杂合型实验2实验2等位基因型分析的原理与点突变分析方法相同SNP分析：SNPs，即单核苷酸多态性，这种人类最常见的可遗传变异占据了所有已知多态性的90%以上，因此作为研究个体对不同疾病的易感性或者个体对特定药物的不同反应有着重要的意义，也因此国际人类基因研究学会花费大量的资金来完成人类单体型图谱。SNP分析从根本上来说其实就是确定一对染色体的每种基因的

20、两个拷贝，哪种点突变在这两个拷贝中存在，因此利用定量PCR方法，并配合芯片技术可以快速灵敏的检测到SNP结果。ABI号称有数以千记的定量PCR试剂盒，自然在这方面也不会留下空白，TaqMan SNP Genotyping Assays包含了一百万的HapMap SNPs（人类单核苷酸多态性图谱SNPs），方便SNP分型高通量研究。DNA甲基化分析：CG 岛内胞嘧啶的甲基化形成 5-甲基胞嘧啶被认为和许多人类疾病特别是癌症有关。Laird 等人利用一种被称作 Methylight 的技术。 Methylight 是一种基于 Taqman 探针的甲基化特异定量 PCR 技术。在扩增之前先处理 DN

21、A ，使得未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影响，用特异性的引物和 Taqman 探针来区分甲基化和非甲基化的 DNA ，这种方法不仅方便而且灵敏度更高。特异的引物和 Taqman 探针被用来区分甲基化和非甲基化的 DNA 。和其它实时 PCR 方法一样，Methylight无需电泳，因而提高了反应的灵敏性和通量。这种方法的灵敏性在食道癌病人血液中癌细胞异常甲基化的DNA检测中被证明。熔解曲线分析 HRM（High Resolution Melt）是一种最新（2007年开发出来）的遗传学分析手段 每一段DNA都有其独特的序列，包括长度、GC含量及碱基的互补性差异，这样每个DNA片

22、段都有独特的熔解曲线形状 HRM曲线是根据扩增子（amplicon）中的碱基差异（包括缺失、增加、或单碱基变化）的溶解曲线进行高分辨处理后区分的，精度达到单碱基差异。 Identical reaction components, except initial template concentration varies10,000 copiesNon-specific productAmpliconAmplicon10 copies熔解曲线分析SYBR Green I通过产物的Tm值来确定产物-可区分单一产物、变异产物、多种产物、引物二聚体10,000 copies10 copies0 copi

23、es Melting curve resultsAmplification results1. 95oC for 5 min2. 94oC for 10 sec3. 63oC for 15 sec4. 72oC for 30 sec5. Plate Read6. 84oC for 1 sec7. Plate Read8. Go to line 2 39 more times9. Melting curve from 65oC to 95oC, read every 0.2oC, hold 1 sec.熔解曲线分析实验31. 95oC for 5 min2. 94oC for 10 sec3. 63oC for 15 sec4. 72oC for 3