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文档简介

1、 分子生物学研究方法 PCR技术在医学中的应用一.多聚酶链反应(Polymerase Chain Reaciton,PCR)（一）原理热变性（94度）引物退火（55度）延伸（72度）DNA聚合酶dNTP变性退火引物经2530次循环，目的DNA增加166-7（2）引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶堆积现象， 引物G+C含量宜在4555%左右。（3）引物内部不应形成二级结构，两个引物之间尤其在3末端不应 有互补链存在。（4）引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。要求在引物设计时 进行辅助检索分析。（5）引物3末端碱基：原则上要求引物3末端与模板DNA一定要配对。 另外引物3末端的末位碱基

2、在很大程度上影响着Taq DNA聚合酶 的延伸效率。研究表明，引物3末端碱基在错误配对时，不同碱基 的引发效率存在很大差异。当末位碱基为A时，即使在错配的情 况下，也能引发链的合成。而末位碱基为T时，错配时引发效率 大大降低。G,C居于中间，所以3末端的末位碱基最好选T,G,C而 不选A.(6) 引物5末端碱基：PCR反应物5末端碱基并没有严格限制， 只要与 模板DNA结合的引物程度足够，其5末端碱基可以不 与模板DNA匹 配，而呈游离状态。这样引物设计时可以在5末端加上限制性内切酶 位点或其他短的序列。可以加ATG起始密码，可以加错配碱基造 成突变。3。PCR反应缓冲液：组成50mM KCl

3、10mM Tris.Cl (pH 8.4)1.5mM MgCl2Mg+是Taq酶活性所必需的金属离子。 Mg+浓度的高低能影响反应的特异性和扩增片断的产率。1.52.0mM Mg+是比较合适的。 Mg+过量能增加非特异性扩增并影响产率。4。底物dNTP浓度在PCR反应中，dNTP浓度应在20200uM, dNTP浓度过高可加快反应速度。同时，还可增加碱基的错误掺入率和实验成本。反之，低浓度的dNTP会导致反应速度的下降，但可提高实验的精确性。此外，由于dNTP可能与Mg+ 结合，因此应注意Mg+浓度和dNTP浓度之间的关系。二 PCR的应用（一）未知DNA片断的克隆 1，基因组DNA步移法 1 2 3 4 5已知DNA序列接头接头PCR2，

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