兔眼IPE与RPE细胞膜表面KNPPase酶组织化学的电镜图像分析

1、兔眼IPE与RPE细胞膜外表K-NPPase酶组织化学的电镜图像分析【摘要】为了讨论自体虹膜色素上皮细胞IPE能否代替视网膜色素上皮细胞RPE移植到视网膜下腔执行物质转运功能，对兔眼IPE与RPE细胞膜外表的Na+，K+-ATPase采用K-NPPase酶组织化学技术进展定位和分析比拟。方法：家兔12只，取IPE和RPE组织固定，配制孵育液后进展K-NPPase酶组化孵育，制成电镜标本，采集图像，利用etarph/DP10/BX51系统进展分析。随机选取IPE细胞膜以及RPE细胞顶端相邻K-NPPase颗粒两点间的间隔 进展测量。计算每组样本的均值标准差xs，进展成组设计材料的t检验。结果：有

2、色素组与无色素组汇总后的IPE细胞膜上K-NPPase颗粒的间隔 平均值40.161.19n，RPE顶端微绒毛细胞膜上K-NPPase颗粒的间隔 平均值为41.071.78n，两者之间的差异无显著性意义0.5P0.2。结论：兔眼IPE细胞膜外表与RPE细胞顶端微绒毛膜外表均有Na+，K+-ATPase分布，采用K-NPPase酶组化电镜观察到的兔眼IPE细胞与RPE细胞可能具有相似的物质转运功能。【关键词】虹膜色素上皮细胞0引言近年来，随着视网膜玻璃体手术技术和细胞培养技术的成熟，通过自体色素上皮细胞移植治疗老年性黄斑变性ARD，进步和挽救ARD患者的视力成为可能。由于虹膜色素上皮细胞IPE与

3、视网膜色素上皮细胞RPE有一样的组织来源，且取材容易，人们寄希望于通过自体IPE细胞移植来重建视网膜光感受器复合体的构造与功能。大量报道也证明了IPE细胞与RPE细胞具有相似的吞噬功能1-4、摄取和贮存维生素A的功能5及产生细胞外间质的功能6，但是关于二者物质转运功能的量化比拟研究甚少。我们通过钾依赖性对硝基苯磷酸酶K-NPPase组化方法7显示IPE与RPE细胞膜外表的钠钾ATP酶Na+，K+-ATPase，对二者的物质转运功能进展量化分析比拟，为进一步阐述IPE代替RPE自体移植的可行性提供理论根据。1材料和方法1.1材料安康有色素家兔与白色家兔各6只，由中国医科大学实验动物部提供，质量2

4、.53.0kg，平均兔龄6，雌雄不限。成组设计为有色素组12眼和无色素组12眼；有色素组和无色素组又分别分为IPE组和RPE组各12例。耳缘静脉注射5.0L空气处死后，无菌操作下摘取家兔双眼球。用40g/L多聚甲醛和5g/L戊二醛混合液含60g/L蔗糖球内灌注及浸泡固定，4，45in，将组织切成24的薄块。1.2方法K-NPPase酶组化孵育液配制7：于1l/L甘氨酸KH缓冲液pH9.0中参加左旋咪唑6.02g及对硝基苯磷酸g盐24g,充分混匀溶解，渐渐滴入DS2.5La液将枸橼酸铅溶于50l/L的KH溶液中配成4.0l/L浓度的溶液，摇匀使之溶解b液。将所配制的枸橼酸铅-KH溶液b液缓慢滴入

5、a液中，最终孵育液呈半透明微绿色。K-NPPase酶组化孵育：将组织薄块浸入孵育液中，置于37温箱中，孵育4050in。将孵育后的组织薄块用100l/L二甲砷酸缓冲液洗涤5in；置于10g/L锇酸100l/L二甲砷酸缓冲液中固定30in；用100l/L二甲砷酸缓冲液冲洗2次，各5in；依次用梯度乙醇脱水，再用纯丙酮浸30in2次；环氧树脂Epn812浸透、包埋、聚合；切半薄切片后在光镜下定位，修块；超薄切片70n，醋酸双氧铀电子染色10in，烘干；电镜观察，拍照。采用etarph/DP10/BX51系统分析电镜照片。随机选取IPE细胞膜上K-NPPase的阳性颗粒以及RPE细胞顶端和RS相接的

6、微绒毛上的阳性颗粒相邻两点间的间隔 进展测量。统计学处理：计算每组样本的均值标准差xs，95%可信区间，分别对有色素组和无色素组的IPE组与RPE组数据进展统计学分析比拟，最后再对总的IPE组和RPE组进展t检验。2结果电镜下RPE细胞顶端伸出大量微绒毛包绕RS，沿绒毛膜处可见K-NPPase颗粒沉积图1；IPE细胞之间有许多微绒毛互相穿插盘绕，在其外表可以见到大量K-NPPase颗粒沉积，沿细胞膜成行排列位于细胞质侧图2。这两种组织与其它未被K-NPPase着染的组织相比，定性观察结果呈明显阳性。有色素组与无色素组汇总后的IPE细胞膜上K-NPPase颗粒的间隔 平均值40.161.19n，

7、RPE顶端微绒毛细胞膜上K-NPPase颗粒的间隔 平均值为41.071.78n，两者之间的差异无显著性意义0.5P0.2，表1。图1视杆细胞外节；RPE细胞顶端；微绒毛膜外表的K-NPPase沉积颗粒，醋酸双氧铀染色35000图2IPE细胞纵横交织的微绒毛边缘可见成排的K-NPPase沉积颗粒，醋酸双氧铀染色350003讨论Shraereyer等8应用酶联免疫细胞组织化学观察体外培养的IPE细胞具有Na+，K+-ATPase活性，但这只是定性观察结果。众所周知在RPE细胞顶端微绒毛膜上也存在Na+，K+-ATPase9，我们希望通过一种量化的方法比拟二者的差异。ayahara等7开发的钾依赖

8、性对硝基苯磷酸酶K-NPPase组织化学方法，K-NPPase在钾离子存在的情况下，能水解对硝基苯磷酸，这个反响可以被Na+，K+-ATPase的特异性抑制剂奎巴因所抑制，而且在高倍电镜下K-NPPase的反响产物位于细胞膜的细胞质侧，这与Na+，K+-ATPase脱磷酸反响过程中磷酸释放的方向一致，更进一步说明K-NPPase是Na+，K+-ATPase中钾离子依赖性脱磷酸反响局部。K-NPPase在视细胞内节盘膜外表呈明晰排列图3代表了Na+，K+-ATPase的分布，是光感受器进展正常光电化学反响的前提与根底10。我们通过K-NPPase组织化学方法来显示正常生理状态下IPE与RPE细胞

9、膜外表的Na+,K+-ATPase的活性分布，并创造性的通过etarph系统测量电镜图像中K-NPPase沉积颗粒的间隔 ，对其分布密度进展量化评价、分析比拟。图3视网膜外核层明显可见K-NPPase沉积颗粒，醋酸双氧铀染色18000K-NPPase酶组化孵育液的配制需严格遵循ayahara等7开发的K-NPPase酶组织化学方法。其pH值要求很高，只有在pH8.89.0时K-NPPase活性才能显示出来。孵育液中参加左旋咪唑是为了抑制其他非特异性碱性磷酸酶活性，参加DS可以增强K-NPPase的活性，参加枸橼酸铅捕捉剂可以与Na+,K+-ATPase水解ATP后释放的游离磷酸根离子发生沉淀反

10、响。固定液采用了40g/L多聚甲醛和5g/L戊二醛混合液含60g/L蔗糖，可以使K-NPPase在足够长的时间内1h不失活，而同样含NPPase的g2+-ATPase在此固定条件下那么完全失活，由此排除了g2+-ATPase反响颗粒对本实验的影响。K-NPPase酶组化电镜染色与其他电镜染色不同之处在于未参加枸橼酸铅，而只用醋酸双氧铀进展染色，目的是为了能分辨出细胞膜外表的K-NPPase，但缺点是未能使细胞器及细胞核膜等进一步着染。我们通过etarph/DP10/BX51系统，对每张电镜照片的标尺进展换算后，测量相邻K-NPPase颗粒间间隔 。在数据采集的过程中，为了防止细胞膜重叠所造成的

11、误差，我们选取了RPE与视杆细胞外节RS衔接的部位，由于光感受器外节无Na+，K+-ATPase10，如本实验所观察到的图3，可以认为与RS相衔接的RPE细胞顶端微绒毛膜上的K-NPPase颗粒皆为RPE细胞所有；而为了防止IPE细胞之间严密接触部位计数时对双层细胞膜外表的K-NPPase颗粒重叠计量所造成的误差，测量时选取了IPE游离的微绒毛外表的K-NPPase颗粒；另外，据记载RPE顶端与RS衔接的部位Na+，K+-ATPase的密度较高图49，因此特别选取该部位与IPE进展比拟。尽管在不同的放大倍率下得到的组间的平均间隔 变异系数稳定(24.791.02)，但为了消除放大倍率不同所可能

12、产生的系统误差，所有被采集照片放大倍率仍被限定为35000倍。值得注意的是，在电镜观察过程中11，可以发现有色素组的IPE或RPE细胞质内色素小体的膜上有成行排列的K-NPPase颗粒，本结果中IPE或RPE的有色素组与无色素组K-NPPase颗粒间隔 的差异有非常显著性意义P0.001。故我们推测这种差异可能与细胞质内含有色素颗粒的多少有关。图4黑色素颗粒；视杆细胞外节盘膜；RPE细胞层；脉络膜血管腔；RB；Bruh膜构成完好的光感受器复合体，进一步放大可见RPE顶端具有K-NPPase沉积颗粒，醋酸双氧铀染色27500在本实验中，有色素组的IPE组与RPE组的差异无显著性意义0.5P0.2

13、；无色素组的IPE组与RPE组的差异有非常显著性意义P0.001；有色素组和无色素组汇总后的IPE细胞膜上的K-NPPase酶颗粒的间隔 平均值40.161.19n，RPE细胞顶端微绒毛膜上K-NPPase颗粒的间隔 平均值为41.071.78n，二者的差异无显著性意义0.5P0.2。由此可以推知IPE细胞膜上K-NPPase颗粒的密度与RPE顶端的微绒毛膜上的密度相近，也就是Na+，K+-ATPase的密度相近，故推测兔眼IPE细胞与RPE细胞具有相似的物质转运功能。我们通过对兔眼IPE细胞和RPE细胞物质转运功能的量化比拟研究，初步证明了IPE细胞完全可能代替RPE细胞在视网膜下腔发挥物质

14、转运功能，重建光感受器复合体的构造与功能。结合以前的相关报道，IPE细胞与RPE细胞生理功能的很多相似之处。相信，随着研究的进一步深化和我们对IPE和RPE细胞生理功能认识的加深及IPE细胞培养技术的成熟和玻璃体视网膜手术的不断开展，自体IPE移植将有希望为ARD患者带来光明。【参考文献】1李毅斌.虹膜色素上皮细胞的培养及移植.国外医学眼科学分册,1999;23(3):129-1332ShraereyerU,KikN,HEiannK.ResueeffetsfIPEtransplantsinRSrats:shrt-terresults.InvestphthallVisSi,1999;40(7):

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