猪流行性腹泻病毒FJLY1703株ORF3基因遗传进化及序列分析

1、猪流行性腹泻病毒FJLY1703株ORF3基因遗传进化及序列分析摘 要:将PEDVFJLY1703株ORF3基因进行RT-PCR扩增并进行遗传进化和序列分析，结果表明,FJLY1703 株ORF3基因核苷酸序列与2010年以后中国变异株的一致性为97.8%99.6%，与疫苗株CV777的同源性为 95.6%. FJLY1703株与疫苗株CV777亲缘性较远，并存在与疫苗株CV777不同的抗原表位。重组分析表明 FJLY1703株ORF3基因没有发生重组事件，且易出现变异。关键词：猪流行性腹泻病毒；ORF3;进化特征Analysis of the Genetic Evolution and Se

2、quence of the ORF3 Gene on theFJLY1703 Strain of Porcine Epidemic Diarrhea VirusAbstract: The ORF3 gene of the PEDVFJLY1703 strain was amplified by RT-PCR, and genetic evolution and sequence analysis were performed. The results showed that the nucleotide sequence of the ORF3 gene of the FJLY1703 str

3、ain was 97.8% to 99.6% identical to the Chinese variant strain after 2010, which was comparable to the vaccine strain. The homology of CV777 is 95.6%. The FJLY1703 strain is far from the vaccine strain CV777 and has a different epitope from the vaccine strain CV777. Recombination analysis showed tha

4、t the ORF3 gene of FJLY1703 strain did not undergo recombination events and was prone to mutation.Key Words: Porcine Epidemic Diarrhea Virus; ORF3; evolutionary characteristics猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)以哺育仔猪最为易感，死亡率达到 80100%1,2。1984年PEDV在我国首次报道，继 而呈现大面积流行趋势3。张志等人对我国29个 省(市)的猪腹泻性

5、疾病样品进行检测分析发现， 引起我国猪群腹泻的主要病原为PEDV。因此， 及时有效的检测可以降低PEDV对养猪业的威胁。PEDV由4个结构蛋白和2个非结构蛋白构 成，排列顺序为：5-ORF(la/lb)-S-ORF3-E-M-N-3 6,7。目前，对非结构蛋白ORF3基因的功能了解 甚少。有学者指出，ORF3基因包含4个跨膜区， 并能够形成四聚体结构，具有离子通道活性，从 而影响病毒毒力8。也有学者认为，ORF3基因对 病毒的适应性和毒力的影响可作为PEDV强、弱 毒株的鉴定依据9,10。分子结构特征表明ORF3基 因存在易变异的区域片段，遗传进化具有不稳定 性11。因此，ORF3可作为PED

6、V流行病学研究的 靶基因。2010年末，我国大多数省份暴发PED，疫情 蔓延迅速，接种过PEDV疫苗的猪只同样发病， 给我国养猪业带来巨大经济损失122011年冬末， 广东、福建等地区持续暴发仔猪腹泻，而造成PED 流行的原因是PEDV发生突变，即出现PEDV新 型变异株13因此，掌握PEDV的流行规律和遗 传进化关系是必要的。本研究从闽西地区送检仔 猪组织样本中分离出PEDV FJLY1703株，已对该 毒株4个主要结构基因进行了遗传进化分析，证 明为PEDV新型变异株。然而，考虑到0RF3基 因在病毒研究中的价值，本研究对FJLY1703株的 ORF3基因进行扩增与测序，并与国内外毒株 O

7、RF3基因序列进行同源性分析、绘制系统发育进 化树、抗原表位预测比较以及重组分析。1材料与方法1.1病毒与试剂PEDV FJLY1703株由福建省家畜疫病防治与 生物技术重点实验室分离并保存。TransZol Up Plus RNA Kit、EasyScript One-Step RT-PCR SuperMix、EasyScript Quick Gel Extraction Kit、 EasyScript Plasmid MiniPrep Kit，购自北京全式 金生物技术有限公司。1.2病毒总RNA的提取取肠道样品约40 mg放入预冷的研钵内部， 研磨至糜烂状，加入400四L PBS。转入到1

8、.5四L EP 管中，按照操作步骤依次加入1 ml TransZol，200四L 氯仿，等体积无水乙醇，500四L裂解液，500四L 洗涤液。离心洗脱后，-80 C保存。1.3 ORF3基因的扩增与纯化参考GenBank已收录PEDV毒株的ORF3序 列，使用Premier Premier 5.0生物软件设十一对特 异性引物 PEDV-ORF3-F (AAGGTCTACGTGCAG TGATGT)和 PEDV-ORF3-R (TACTAGACCATTAT CATTCACT)。以RNA为模板，进行一步法RT-PCR 扩增。PCR反应程序为：45 C逆转录30 min。95 C 预变性5 min，

9、94 C变性30 s，55 C退火30 s， 72 C延伸1 min， 35个循环，72 C延伸10 min。 使用琼脂糖凝胶电泳进行检测，观察并记录结果。 将阳性样品按照 EasyScript Quick Gel Extraction Kit操作说明进行纯化。1.4同源性及遗传进化分析从NCBI获取参考毒株的核苷酸序列与氨基 酸序列。使用MGEM5.214及DNAMAN分子生物 学软件，分析FJLY1703 ORF3基因序列与国内外 已发表毒株序列同源性及遗传进化关系。1.5氨基酸序列及潜在抗原表位分析使用DNAMAN对FJLY1703毒株、早期疫苗 株CV777以及其它引用毒株的ORF3氨

10、基酸易变 位点进行分析并记录结果。使用在线软件NetMH C 4.0 Serve ( HYPERLINK /proteomics /proteomics) 对FJLY1703毒株、早期疫苗株CV777以及其它 引用毒株ORF3基因潜在抗原表位进行预测分析， 并记录结果。1.6 ORF3基因的重组分析分析FJLY1703株与本研究中下载的其它 PEDV病毒株ORF3基因核苷酸序列的相似性和重 组事件。利用遗传算法重组检测(GARD)对重组 位点进行筛选15。使用SimPlot 3.5对核酸相似性 进行扫描分析16。2结果2.1 PCR扩增结果M 122000b1000b 750bp 500bpM

11、 122000b1000b 750bp 500bp250bplOObp7OObp图1 ORF3基因PCR扩增产物M： Marker DL 2000； 1：阴性对照(未添加病毒总RNA)；2: ORF3目的片段PCR结果显示获得基因片段大小约为7OO bp (见图1)。PCR产物测序后经BLAST比对鉴定 为PEDV ORF3基因。2.2同源性及遗传进化分析FJLY1703株ORF3基因核苷酸序列与21株引 用毒株之间的一致性为95.6%99.6%，与2010年后中国变异株的一致性为97.8%99.6%,与疫苗株 CV777的一致性为95.6%。22株毒株可分成2大 群，G1群和G2群（见图2）

12、。其中，G2大群还可 细分为G2a和G2b两个亚群，而早期韩国疫苗株 virulent DR13、本研究分离株FJLY1703株以及其 它流行变异株同属G2b亚群。AH2012CH-ZMDZY-11 FJLY1703Attenuated DR13图2 ORF3遗传进化分析JS-HZ2012CH-FJND-3-2011-virulent DR13CH-FJZZ-9-2012CH-GDGZ-2012AJ1102CHGD-01KC189944CV777JS2008 KC109141JS2008 KC2101462.3氨基酸序列分析AH2012CH-ZMDZY-11 FJLY1703Attenuate

13、d DR13图2 ORF3遗传进化分析JS-HZ2012CH-FJND-3-2011-virulent DR13CH-FJZZ-9-2012CH-GDGZ-2012AJ1102CHGD-01KC189944CV777JS2008 KC109141JS2008 KC210146与早期疫苗株CV777相比，ORF3基因推导 的氨基酸序列中存在7处突变，分别为20V-A， 53V-I，78V-I，79F-V，91L-F，100A-T，165N-S， 181H-Q，这些突变位点与2010年后中国变异株 一致。2.4抗原表位预测分析通过在线软件NetMHC 4.0 Serve预测ORF3 氨基酸抗原表位

14、区域，结果显示，CV777株与 FJLY1703株ORF3基因中存在3处不同的抗原表 位区域，其余抗原表位区域均相同。而FJLY1703 株与国内流行变异株抗原表位位置相同，没有明显差异表1（见表1）。FJLY1703与CV777 ORF3抗原表位差异位点毒株77-86aa抗原表位区域91-99aa181-189aaCV77777vvflycpll85/181hllrtvell189FJLY1703/91fldatiicc99/2.5 ORF3基因核酸相似性GARD分析显示ORF3核苷酸序列中 不存在断点，没有发生重组现象。使用Sim- Plot 3.5对核酸相似性进行扫描显示，FJLY 17

15、03 株ORF3基因核苷酸算序列与同属G2a亚群中其 它毒株核酸相似度高，而与G2b亚群和G1群毒株 相似度低（图32.5 ORF3基因核酸相似性核苷酸位置（nt）图3 核苷酸位置（nt）图3 FJLY1703株与其它毒株ORF3基因核酸相似性同源性及遗传进化分析表明，FJLY1703株 ORF3基因与我国其它分离毒株具有很高的同源 性，这与之前报道FJLY1703株N、E、M和S基 因结果相一致17，进一步证实闽西FJLY1703株属 于2010年后国内流行变异株。当前，国内已有多 个地区开展了 PEDV ORF3基因的遗传进化分析， 学者们普遍认为当前PEDV国内流行变异株与早 期经典疫苗

16、株CV777遗传关系较远。朱前磊18等 对2015-2017年河南地区15株PEDV ORF3基因 遗传进化分析后表明，河南毒株ORF3基因与国内 流行变异株遗传关系较近，且与经典疫苗株 CV777遗传关系较远。向萌19等对四川地区PEDV SCXM株ORF3基因同源性分析后显示，SCXM 与经典疫苗株同源性较低，属于国内PEDV新型 变异株，表明以CV777株为免疫原制备的疫苗可 能对当前猪群保护效果不理想。序列分析表明，FJLY1703株与早期疫苗株 CV777相比，ORF3基因推导的氨基酸序列中存在 与流行变异株 7 相同突变位点，推测这些突变可能导致PEDV的毒力差异，从而加剧了 20

17、10年疫 情危害。此外，FJLY1703株并未显示ORF3序列 缺失，与其它国内流行变异毒株相一致，说明 FJLY1703株为PEDV野生型毒株。抗原表位预测 分析显示，FJLY1703株与早期疫苗株CV777存在 3处不同表位区域，说明FJLY1703株与早期疫苗 株CV777抗原表位存在不同，这可能是免疫失败 的原因之一。并且，FJLY1703株与其它国内流行 变异株抗原表位预测结果相同，证明国内流行变 异株ORF3基因抗原表位之间具有相对保守的特 性，预测的抗原表位可以作为研制PEDV靶向性 疫苗的候选靶点。此外，本研究显示早期韩国疫苗株virulent DR13与国内流行变异株亲缘关系较近。有报道推 测变异株N基因可能来源于早期韩国株17-20。本 研究表明FJLY1703株等国内流行变异株ORF3基 因与韩国virulent DR13也具有较高的亲缘关系， 推测国内流行株ORF3基因也