时间分辨技术的原理

1、 PAGE 31时间分辨技术的原理目前最先进的免疫检测技术：时间分辨原理： 用三价稀稀土离子子及其鳌鳌合剂作作为示踪踪物，代代替荧光光物质、同同位素或或酶，标标记蛋白白质、多多胎、激激素、抗抗体、核核酸探针针或生物物流行性性细胞，当当反应体体系发生生后，用用时间分分辨仪器器测定最最后产物物中荧光光强度。根根据荧光光强度或或相对荧荧光强度度比值，来来判断反反应体系系中分析析物的浓浓度，达达到定量量分析之之目的。时间分辨原原子标记记物的特特点：发射光和激激发光有有较大的的STOOKESS位移高特异异性长寿命荧光光，降低低其他物物质的荧荧光干扰扰高灵灵敏度半衰期长达达几十万万年，试试剂受干干扰小高稳

2、稳定性原子标记与与大分子子标记物物的对比比 原 子子 标 记 物物 大大 分 子 标标 记 物标记位点多个,可达达20个个只有1个对被标记物物蛋白活活性的影影响影响小,基基本无影影响影响大,经经常影响响蛋白活活性对被标记物物空间结结构的影影响无影响,保保证稳定定性影响大,造造成试剂剂的不稳稳定受环境因素素的影响响影响小影响大,温温度影响响3、波长分分辨：标记离子的的荧光激激发光波波长范围围较宽，发发射光光光谱范围围较窄，是是类线光光谱，有有利于降降低本底底荧光强强度，提提高分辨辨率。激发与发射射光之间间有一个个较大的的STOOKESS位移，有有利于排排除非特特异荧光光的干扰扰，增强强测量的的特

3、异性性。4、时间分分辨：标记离子螯螯合物产产生的荧荧光强度度高，寿寿命长，有有利于消消除样品品及环境境中荧光光物质对对检测结结果的影影响。每一秒名检检测样品品10000次，取取其中不不受干扰扰的4000次的的均值作作为测定定值，有有利于提提高检测测的准确确性。时间分辨技技术取代代酶免、放放免是免免疫检测测技术发发展的必必然趋势势！RIA（放放免）放射性（1125II），对对环境和和身体的的危害，已已经为重重视环保保的国家家逐步取取消，如如整个欧欧洲仅尚尚存几个个放免试试验室。125I半半衰期短短，导致致试剂的的有效期期短，需需每次定定标，造造成很大大的浪费费。由于标记物物（1225I）的的不断

4、变变化，带带来药盒盒批间、批批内较大大的变异异，标准准曲线无无法保存存备用。ELESAA（酶免免）灵敏度、重重复性不不及放免，易易造成漏漏检和假假阳性。酶的纯度和和反应过过程容易易受环境境因素影影响，导导致稳定定性、重重复性不不好。与其它技术术的相对对优势：（1）、是是现有的的免疫检检测方法法中灵敏敏度最高高的（2）、是是现有的的免疫检检测方法法中稳定定性最好好的（3）、多多标记检检测是目目前所有有免疫检检测技术术中独一一无二的的TRF技术术与电化化学发光光的比较较时间分辨荧荧光电化学发光光标记物四种原子:Eu,Sm,Te,Dy一种原子:钌多标记技术术有无科研项目能(10000多种种科研项项目

5、)无试剂种类58种临床床,244种科研研,共882种40种临床床,无科科研试剂价格低高TRF与化化学发光光的比较较时间分辨荧荧光化学发光发光效率95%1%重复检测可无数次重重复不可重复本底噪声零本底干扰大灵敏级数10-19910-155标记物原子大分子化合合物标记位点每个抗体可可达200个1个标准曲线稳定达一年年以上稳定2到44周多标记有,最多可可达四标标记无科研开发有无时间分辨荧荧光免疫疫定量分分析简介介时间分辨荧荧光分析析（Tiimerresoolveed Fluuorooimmmunooasssay,TRFFIA）是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物

6、的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。解离增强镧镧元素荧荧光免疫疫分析是是时间分分辨荧光光免疫分分析中的的一种。它它用具有有双功能能基团结结构的螯螯合剂，使使其一端端与铕（EEu）连连接，另另一端与与抗体/抗原分分子上的的自由氨氨基连接接，形成成EU标记记的抗体体/抗原原，经过过免疫反反应之后后生成免免疫复合合物。由由于这种种复合物物在水中中的荧光光强度非非常弱，因因此加入入一种增增强剂，使使Eu33+从复复合物上上解离下下来，自自由Euu3+同同增强剂剂中的另另一种螯螯合剂螯螯形成一一种胶态态分子团团，

7、这种种分子团团在紫外外光的激激发下能能发出很很强的荧荧光，信信号增强强了百万万倍。因因为这种种分析方方法使用用了解离离增强步步骤，因因此称为为解离增增强镧系系元素荧荧光免疫疫分析。乙肝病毒（HHBV）标记物的检测方法常用测定乙肝病毒的抗原、抗体标记物，由60年代末70年代初的琼脂扩撒法，依次发展为血凝法酶联免疫吸附（ELISA）、同位素免疫标记（RIA）化学发光免疫分析、生物发光、电化学发光免疫标记和80年代中建立的稀土离子荧光标记（时间分辨荧光免疫分析）等不同的检测方法。随着科学的发展和检验技术的进步，其方法每发展一步，乙肝标记物检出的灵敏度和准确性都得到不同的提高。时间分辨荧荧光免疫疫分析

8、（TTRF）为近年新研制成功的用三价稀土离子作为示踪物，以单克隆抗体包被支持物与样品中抗原反应，再加入有铕（EU）标记的抗体，进行反应检测，可大大降低一般同位素和荧光标记受环境干扰缺点，提高了检测的灵敏度和准性，该TRF法检测乙肝病毒标记物较其他方法灵敏度高、特异性好，干扰因素少，TRF为目前检测乙肝病毒标记物最理想的方法。TRF定量量检测乙乙肝病毒毒“两对半半”为临床床诊断乙乙肝提供供了新手手段，有有助于临临床客观观的分析析HBVV感染情情况、疗疗效的观观察和转转归等情情况的分分析，至至少可对对下列情情况更具具有独特特的诊断断价值：1、治疗前前进行病病毒定量量检测，可可以指导导选择抗抗病毒药

9、药物，避避免盲目目用药。2、治疗后后定量间间接判断断体内病病毒数量量，有助助于疗效效的观察察。 3、怀孕孕前进行行定量测测定，有有助于选选择有利利于的怀怀孕时机机。乙肝肝孕妇进进行定量量检查，有有助于使使部分病病人得到到及时的的正确的的诊断 目前我科已已正式开开展了乙乙肝二对对半的TTRFIIA定量量分析，其其每一项项的正常常值范围围均是由由我国卫卫生部根根据美国国雅培的的标准而而制定，其其灵敏度度，准确确度，及及精确度度都有远远远优于于一般的的ELIISA法法，乙肝肝两对半半的定量量制定将将给临床床提供一一个关于于乙肝诊诊断及疗疗效，预预后判断断的更可可靠的实实验结果果。极大地提高高了检测测

10、的灵敏敏度 时时间分辨辨荧光免免疫定量量技术（TTRFIIA）检检测HbbsAgg灵敏度度可达00.2nng/mml,而而酶标（EEIASSA）检检测的灵灵敏度是是2ngg/mll,极大大地提高高检测的的灵敏度度。因此此，在急急性乙肝肝早期能能及早检检出HbbsAgg，确证证HBVV感染，缩缩短窗口口期；其其次，可可发现低低浓度HHbsAAg携带带者；在在部分慢慢性乙肝肝患者中中，由于于机体缺缺乏对HHBV包包蟆蛋白白的免疫疫应答，HbsAg表达较低，酶标检测可出现HbsAg和HbsAb均阴性的情况，TRF技术则可避免这些情况的发生，为正确判断病情提供依据。能动态观察察疗效和和监测病病情定量分

11、析HHBsAAg和HBssAb的的浓度变变化，可可预见急急性乙肝肝是否处处于恢复复期。如如HBssAg浓浓度降低低，HBBsAbb浓度逐逐渐升高高，可说说明病情情正往恢恢复期发发展；反反之，HHBsAAg浓度度处于较较高水平平或上升升趋势，而而HBssAb一一直处于于较低水水平，则则易发展展为慢性性乙肝或或病毒携携带者。定量分析HHBeAAg和HBeeAb的的浓度变变化，可可反映病病情变化化和治疗疗效果。定定量测定定能明确确检测 HBeeAg和和HBeeAb转转换的时时期，即即表现为为HBeeAg浓浓度下降降和HBBeAbb升高的的过程。高高浓度的的HBeeAg还还可间接接提示病病毒处于于高复

12、制制状态，具具有较高高传染性性。高浓浓度的HHBeAAb一方方面提示示病情好好转而在在某些时时候（如如肝功能能指标很很差）则则可能与与肝坏死死、肝硬硬化、肝肝癌有关关。HBcAbb浓度的的高低可可反映病病毒感染染的状态态。高浓浓度的抗抗-Hbbc提示示乙肝性性感染，恢恢复期浓浓度降低低。慢性性乙肝呈呈抗-HHbc持持续高浓浓度。而而低浓度度的抗-Hbcc一般为为恢复期期或既往往感染。有利于对慢慢性肝炎炎活动性性或非活活动性的的判断。非非活动性性慢性乙乙肝各项项指标相相对稳定定，活动动性往往往呈现进进行性变变化。TRFIAA和定量量PCRR技术可可互相补补充血清HBVVDNAA荧光定定量PCCR

13、测定定可以直直接反映映血液中中病毒复复制状态态，具有有很多临临床应用用价值，但但不能完完全反映映病毒复复制静息息期肝细胞胞内HBBV病毒毒状态。HBVDNA阴性并不完全代表体内HBV已被清除，结合“两对半”各项指标更能客观反映体内HBV病毒状态。HBsAbb的定量量测定能能够对乙乙肝的预预防起到到监督作作用 HBsAAb的定定量测定定能够对对抗体是是否真正具有有“中和”HBVV的免疫疫力作出出正确评评价，对对乙肝的的预防起起到监督督作用。HBsAb的含量在10mlU/ml以上病人ELISA检测即可呈阳性结果，但并不提示机体都一定具有免疫力，而HBsAb的含量在10100mlU/ml 之间的样本

14、，定性虽为“阳性”，但此时机体对HBV的免疫力较弱，甚至不能预防HBV感染。只有HBsAb的含量达到100mlU/ml以上时才可确定具有抵抗HBV入侵的作用。作定量检测，可根据HBsAb的含量判断机体对HBV的免疫状态及乙肝苗的免疫效果。因此定量测定对乙肝疫苗免疫力的评价和高危人群预防免疫具有重要意义，特别是在少年儿童预防乙肝方面。乙肝两对半半定量的的临床意意义抗HA定能极早地检检出HBBsAgg，确证证乙肝感感染，几几乎能与与preeSl同同时检测测出。在在乙肝病病程中大大大缩短了了窗口期期的时间间。由于机体常常缺乏对对包膜蛋蛋白的免免疫应答答，HBBsAgg表达较较低，可可出现HHBsAA

15、g、AAntii-HBBs均阴阴性的情情况，定定量检测测HBssAg则则可避免免这些情情况的出出现。病毒发生变变异后，病病毒表达达量较低低，甚至至“定性”检测不不出抗原原。可检检测出HHBsAAg，并并极有可可能同时时检测出出HBssAg、Anti-HBs。国内外学者者研究表表明HBBsAgg的细胞胞免疫应应答与肝肝细胞损损伤有一一定关系系。血清清中HBBsAgg含量和和病人对对HBssAg细细胞免疫疫成反比比关系，而而肝功能能改就则则与此种种细胞免免疫成反反比。而而定量检检测HBBsAgg是反映映这一关关系的唯唯一手段段。一般来说，慢慢性肝炎炎HBssAgCCOI相相对恒定定：而活活动性肝肝

16、炎HBBsAggCOII往往较较高且不不稳定。2、乙肝表表面抗体体（Annti-HBss）定量量Anti-HBss的定量量检测能能够地机机体是否否真正具具有“中和”HBVV免疫力力作为正正确评价价，避免免误误导导病人，对对乙肝的的预防起起到监督督作用。Anti-HBss含理在在101000IU/L之间间的样本本，乙肝肝两对半半定性的的结果为为阳性，但但此时机机体对HHBV并并无中和和作用，仍仍有感染染HBVV的危险险。只有有定量检检测Annti-HBss在1000UII/L以以上时才才具有抵抵抗HBBV入侵侵的作用用。因此此，定量量检测乙乙肝两对对半对乙乙肝疫苗苗免疫力力的评价价和高危危人群预

17、预防具有有重要意意义。3、乙能ee抗原（HHBeAAg）定定量HBeAgg是乙肝肝病毒在在肝细胞胞在繁殖殖时出现现的前CC/C基基因的产产物，经经蛋白酶酶水解后后HBee蛋白质质以非颗颗粒形式式分泌入入血清中中。在急急性HBBV感染染时，血血清中可可出现HHBeAAg，但但维持可可测水平平的时间间很短暂暂（数天天数周）。HHBeAAg阳性性一般是是提示有有大量病病毒存在在，是急急性乙肝肝恢复期期的首选选血清学学指标。由前C基因因突变HHBV感感染所致致的急性性或慢性性乙肝，始始终不出出HBeeAg，但但HBVV-DNNA进行行性复制制。HBBeAgg亦在高高COII水平波波动。与与前者HHBe

18、AAg阳性性慢性乙乙肝类型型中的转转换期比比较，两两对半定定性均表表现为小小三阳，但但后者主主要表现现在高HHBeAAgCOOI值，忽忽高忽低低的ALLT值和和HBVV-DNNA始终终阳性。4、乙肝ee抗体（AAntii-HBBe定量量由HBV野野型株感感染所引引起的急急性或慢慢性乙型型肝炎，其其自然史史分为HHBeAAg阳性性期和AAntii-HBBe阳性期。定定量监测测能明确确出HBBeAgg向Annti-HBee换的时时期，即即表现为为HBeeAgCCOI下下降（含含量降低低）和AAntii-HBBeCOOI下降降（含量量升高）的的过程。因因此，AAntii-HBBe定量量与HBBeAg

19、g定量联联合检测测对监测测HBVV感染的的病程及及药物的的疗效观观察有很很好的实实际意义义。由前C基因因突就株株HBVV感染所所致异型型慢性乙乙肝，由由于患者者始终不不出现HHBeAAg。因因此，长长期监测测患者AAntii-HBBe含量量对判断断其预后后和转归归具有十十分重要要的价值值。5、乙肝核核心抗体体（Annti-HBcc）定量量乙肝病毒由由外壳HHBsAAg和内内核HBBcAgg组成。乙乙肝病毒毒感染期期间，一一般会产产生Annti-HBcc，在HHBcAAg出现现后即可可从血清清中检测测到。偶偶尔也有有Antti-HHBc阴阴性的HHBV感感染者，多多见于免免疫抑制制的病人人。在乙

20、肝感染染康复者者HBssAg携携带者中中，Annti-HBcc可长期期存在。因因此，在在特殊人人群中开开展Annti-HBcc筛选试试验对预预防乙肝肝的传播播有重要要参考价价值。Anti-HBcc定量怀怀其他HHBV试试验一同同检测有有助于乙乙肝感染染的诊断断和监测测。在其其他指标标缺乏的的情况下下（如HHBsAAg阴性性），AAntii-HBBc定量量可能是是现存HHBV感感染的唯唯一指标标。免光测肝毒物临床工作中中发现少少部分经经酶联免免疫吸附附法（EELISSA）检检测仅乙乙型肝炎炎表面抗抗原（HHBsAAg）和和抗HBBc IIgG阳阳性的患患者，病病毒含量量却很高高。为此此，采用用时

21、间分分辨免疫疫荧光分分析法（TTRF）对对34例例此类患患者进行行乙型肝肝炎标志志物（HHBVMM）的检检查，现现将结果果报道如如下：资料与方法法 11.病例选选择：为为20002年22月至99月住院院或门诊诊患者，共共34例例，男221例，女女13例例，年龄龄5558岁，平平均（229.2218.7）岁岁。采静静脉血分分离血清清，用EELISSA进行行HBVV标志物物（HBBV MM）检测测及HBBV DDNA定定量检查查。留取取血清置置-300保存。（11）HBBsAgg、抗HHBc IgGG阳性，乙乙型肝炎炎e抗原原（HBBeAgg）、抗抗-HBss、抗-HBcc IggM阴性性；（22

22、）HBBV DDNA含含量1044拷贝/ml;（3）近近3个月月未使用用抗病毒毒药物。每每人进行行2次抗抗原抗体检查查，结果果一致。22次HBBV DDNA检检查，结结果相差差1个数数量级以以下。2.常规HHBV M检测测：用EELISSA法，试试剂为上上海科华华生物工工程股份份有限公公司产品品，按产产品说明明书操作作。3.HBVV DNNA含理理测定：采用实实时荧光光定量PPCR法法，试剂剂盒购自自广州中中山医科科大学达达安基因因诊断中中心。仪仪器为美美国Peerkiin EElmeer 公公司GeeneAAmp E57700型型PCRR仪。严严格按说说明书操操作，检检测灵敏敏度为1103拷

23、拷贝/mml。 44.TRRF法检检查HBBV MM：试剂剂为上海海新波生生物技术术有限公公司产品品，采用用Anyytesst20000时时间分辨辨检测仪仪。严格格按照说说明书操操作。 5.统计分分析：取取HBVV DNNA含量量的对数数值进行行成组设设计的两两样本均均数比较较，行tt检验。结果 11.HBVV M ：用TTRF法法检查发发现，334例患患者中HHBsAAg、HHBeAAg、抗抗-HBBc阳性性者155例，HHBsAAg、抗抗-HBee、抗-HBcc均阳性性者144例，仅仅HBssAg、抗抗-HBBc阳性性者5例例。即用用ELIISA检检查时HHBeAAg假阴阴性155例，抗抗

24、-HBee假阴性性14例例（表11）。 2.HBBV DDNA含含量：HHBeAAg及抗抗-HBBc均阴阴性组、HBeAg阳性组、抗-HBc阳性组HBV DNA含量的对数平均值分别为6.451.74、7.291.59、5.801.46。将前者与后两组分别进行成组设计的两样本均数比较的t检验，t值分别为1.005、0.816，P值均0.05，差异无显著性。讨论HBV MM的变化化是评估估HBVV感染后后病情转转归的重重要依据据，也是是抗病毒毒治疗的的疗效考考核指标标之一。通通过TRRF检查查发现，大大部分EELISSA法检检测为HHBsAAg、抗抗-HBBc阳性性模式的的患者其其实为HHBeAA

25、g假阴阴性（115/334，444.112%）及及抗-HBee假阴性性（144/344，411.188%）。仅仅少部分分可能为为病毒变变异的结结果。研研究发现现，HBBsAgg、抗-HBcc浓度显显著高于于正常，EELISSA及TTRF符符全率为为1000%，抗抗-HBBs浓度度明显低低于正常常，两者者符合率率为1000%。而而HBeeAg、抗抗HBee浓度仅仅稍高于于正常，因因此ELLISAA易出现现假阴性性。目前前TRFF主要用用于激素素的检测测。随着着仪器及及试剂的的国产化化，检测测费用的的降低，TTRF因因其突出出的高敏敏感性、特特异性强强、无放放射污染染等特点点，在HHBV M的检检

26、测中有有着广泛泛的应用用前景。作者单位：41000111长沙，中中南大学学湘雅二二医院肝肝病研究究中心目前我院已已正式开开展了乙乙肝二对对半的时时间分辨辨定量分分析，其其每一项项的正常常值范围围均是由由我国卫卫生部根根据美国国雅培的的标准而而制定，其其灵敏度度，准确确度，及及精确度度都有远远远优于于一般的的ELIISA法法，乙肝肝两对半半的定量量制定将将给临床床提供一一个关于于乙肝诊诊断及疗疗效，预预后判断断的更可可靠的实实验结果果。时间分辨荧荧光免疫疫定量测测定乙肝肝两对半半的临床床意义极大地提高高了检测测的灵敏敏度时间分辨荧荧光免疫疫定量技技术（TTRFIIA）检检测HBBsAgg灵敏度度

27、可达00.2nng/mml,而而酶标（EEIASSA）检检测的灵灵敏度是是2ngg/ml,极极大地提提高检测测的灵敏敏度。因因此，在在急性乙乙肝早期期能及早早检出HHBsAAg，确确证HBBV感染染，缩短短窗口期期；其次次，可发发现低浓浓度HBBsAgg携带者者；在部部分慢性性乙肝患患者中，由由于机体体缺乏对对HBVV包膜蛋蛋白的免免疫应答答，HBBsAgg表达较较低，酶酶标检测测可出现现HBssAg和和HBssAb均均阴性的的情况，TTRF技技术则可可避免这这些情况况的发生生,为正正确判断断病情提提供依据据。能动态观察察疗效和和监测病病情 1）定定量分析析HBssAg和和HBssAb的的浓度

28、变变化，可可预见急急性乙肝肝是否处处于恢复复期。如如HBssAg浓浓度降低，HHBsAAb浓度度逐渐升升高，可可说明病病情正往往恢复期期发展；反之，HHBsAAg浓度度处于较较高水平平或上升升趋势，而而HBssAb一一直处于于较低水水平，则则易发展展为慢性性乙肝或或病毒携携带者。 22）定量量分析HHBeAg和和HBeeAb的的浓度变变化，可可反映病病情变化化和治疗疗效果。定定量测定定能明确确检测HHBeAg向向HBeeAb转转换的时时期，那那表现为为HBeeAg浓浓度下降降和HBBeAb升升高的过过程。高高浓度的的HBeAg还可可以间接接提示病病毒处于于高复制制状态,具有较较高的传传染性.高

29、浓度度的HBBeAb一方方面提示示病情好好转，而而在某些些时候（如如肝功能能指标很很差）则则可能与与肝坏死死、肝硬硬化、肝肝癌有关关。 33）HBBsAbb浓度的的高低可可反映病病毒感染染的状态态。高浓浓度的抗抗-Hbbc提示示乙肝急急性感染染，恢复复期浓度度降低。慢慢性乙肝肝呈抗-Hbcc持续高高浓度。而而低浓度度的抗-Hbcc一般为为恢复期期或既往往感染。 44）有利利于对慢慢性肝炎炎活动性性或非活活动性的的判断。非非活动性性慢性乙乙肝各项项指标相相对稳定定，活动动性往往往呈现进进行性变变化。TRFIAA和定量量PCRR技术可可互相补补充血清HBVVDNAA荧光定定量PCCR测定定可以直直

30、接反映映血液中中病毒复复制状态态，具有有很多临临床应用用价值，但但不能完完全反应应病毒复复制静息息期细胞胞内HBBV病毒毒状态。HHBVDNAA阴性并并不完全全代表体体内HBBV已被被清除，结结合“两对半半”各项指指标更能能客观反反映体内内HBVV病毒状状态。HBsAbb的定量量测定能能够对乙乙肝的预预防起到到监督作作用吗？HBsAbb的定量量测定能能够对抗抗体是否否真正具具有“中和”HBVV的免疫疫力作出出正确评评价，对对乙肝的的预防起起到监督督作用。HHBsAAb的含含量在1100mmlU/ml以以上病人人ELIISA检检测即可可呈阳性性结果，但但并不提提示机体体都一定定具有免免疫力，而而

31、HBssAb的的含量在在101000mlUU/mll之间的的样本，定性虽为“阳性”，但此时机体对HBV的免疫力较弱，甚至不能预防HBV感染。只有HBsAb的含量达到100mlU/ml以上时才可确定具有抵抗HBV入侵的作用。作定量检测，可根据HBsAb的含量判断机体对HBV的免疫状态及乙肝疫苗的免疫效果。因此定量测定对乙肝疫苗免疫力的评价和高危人群预防免疫具有重要意义，特别是在少年儿童预防乙肝方面。时间分辨荧荧光免疫疫分析在在乙肝的的应用中南大学湘湘雅二医医院肝病病研究中中心教授授：杨旭旭乙肝抗原体体测定是是诊断乙乙肝最常常用的方方法。酶酶联免疫疫测定由由于操作作简便，成成本低廉廉，敏感感性和特

32、特异性较较好，880年代代中期以以来就成成为乙肝肝抗原体体检测最最主要的的方法。但但是本法法只能定定性，作作为定量量测定的的方法，其其重复性性很差。据据观察，不不同乙肝肝感染者者表面抗抗原的浓浓度相差差8000倍,ee抗原的的浓度相相差1000倍，仅仅用“阳性”来表示示，实在在太粗糙糙，太不不科学，难难以满足足临床的的需要。观观察指标标的量化化是提高高诊断水水平的基基本要求求，也是是科学发发展的必必然趋势势，因此此，进入入90年年代以来来，国外外先后推推出第四四代检测测方法：化学发发光法、电电化学发发光法。但但是这两两个方法法需要昂昂贵的设设备，试试剂成本本高，难难以普遍遍应用。 为了满满足临

33、床床的需要要，根据据国情和和省情，我我科瞄准准抗原抗抗体检测测发展的的方向，220022年100月引进进具有世世界先进进水平的的时间分分辨荧光光免疫检检测仪，在在省内率率先建交交时间分分辨荧光光免疫分分析（TTRFIIA）检检测乙肝肝抗原抗抗体的新新方法，我我院也是是国内少少数应用用本法检检测乙肝肝的医院院之一。时时间分辨辨荧光免免疫分析析的原理理和通常常的免疫疫测定方方法基本本相同，只只是标记记物和测测定方法法不同。时时间分辨辨荧光免免疫分析析以三价价稀土离离子（常常用的是是铕）及及其螯合合剂代替替同位素素、荧光光素或酶酶，作为为标记抗抗原或抗抗体的示示踪物，检检测未知知的抗体体或抗原原，用

34、特特制的时时间分辨辨荧光仪仪测定最最后反应应产物中中荧光的的强度，根根据荧光光强度来来判断待待测物质质的浓度度。在免免疫复合合物中的的稀土离离子自身身可产生生微弱的的荧光信信号，而而当加入入增强液液以后，稀稀土离子子从免疫疫复合物物中释放放出来，受受到激发发光照射射时，荧荧光强度度可增强强1000万倍。稀稀土离子子发出性性荧光不不仅光度度强，而而且寿命命长。反反应系统统中许多多物质也也可以发发出荧光光，但他他们的荧荧光的寿寿命极短短，因此此，通过过简单的的延时检检测，就就可以将将特异性性荧光与与非特异异性荧光光区别开开来，所所以这个个方法的的名称冠冠以“时间分分辨”。时间间分辨荧荧光免疫疫分析

35、是是一种超超灵敏的的高度特特异性的的检测技技术，是是今后抗抗原抗体体检测发发展的方方向，其其灵敏度度比化学学发光和和电化发发光高110倍1000倍，比比放免法法和酶标标法高110000倍以上上。据我我科现场场测评，其其特异性性、敏感感性和重重复性均均极强，几几乎没有有假阴性性，假阳阳性率低低于0.1%，同同一标本本连续220次检检测CVV1%，同一一批（110个）连连续3天天检测CCV= 0.99%，检检测后反反应板连连续3天天重复阅阅读CV11%。 这一方方法的建建立必将极极大的提提高我科科的乙肝肝诊断水水平，使使我们对对乙肝感感染者的的病情、预预后、病病毒复制制程度、抗抗病毒药药物的疗疗效

36、等的的判断更更变科学学。乙肝肝时间分分辨荧光光免疫分析析试剂盒盒共5项项，包括括表面抗抗原、表表面抗体体、e抗抗原、ee抗体和和核心抗抗体，可可任选11项或多多项，全全套需备备血3mml（不不加抗凝凝剂），记记账后（每每项455元）标标本送传传染科实实验室，当当天下午午出结果果。时间分辨荧荧光免疫疫测定技技术在HHBVM定量量检测及及临床应应用分析析【摘要】目目的 研研究乙肝肝病毒感感染者血血清免疫疫学标志志物，利利用时间间分辨荧荧光免疫疫分析技技术（TTRFIIA）检检测其含含量结果果与ELLISAA法结果果的任合合程度、灵灵敏度、特特异性；了解TTRFIIA测定定HBVV-M的的准确性性、

37、可行行性及临临床应用用价值。方方法 分分别用TTRFIIA和EELISSA法测测定2660例随随机血清清标本HHBV-M结果果及含量量。结果果HBssAg(ELIISA)阳性336例，TTRFIIA阳性性40例例，x2=4,P00.055,两法法符合率率98.46%；抗-HBss(ELLISAA)阳性性1300性，TTRFIIA阳性性1600例，xx2=300，P0.001，两两法符合合率888.5%；HBBeAgg(ELLISAA)阳性性17例例，TRRFIAA阳性118例，xx2=1，PP0.05，两两法符合合率999.6%；抗-HBee(ELLISAA)阳性性86例例，TRRFIAA阳性

38、773例, x22=6.76，PP0.01，两两法符合合率900.4%；抗-HBcc(ELLISAA)阳性性54例例，TRRFIAA阳性772例，xx2=155.6 ，P0.001，两两法符合合率911.5%；结论论TRFFIA法法与ELLISAA法比较较，特异异性、敏敏感性都都高，TTRFIIA作用用于HBBV-MM含量检检测可为为临床间间接反映映病毒的的感染状状况，同同时也为为临床疗疗效提供供动力学学观察及及接种乙乙肝疫苗苗提供依依据。关键词HBBV-MM时间分分辨荧光光免疫分分析技术术 酶酶联免疫疫吸附试试验【文献标识识码】AA【文章章编号】1606-8106（2004）06-0486-

39、02The ttimee-reesollvedd flluorroimmmunnoasssayy TRRFIAA ussed in theeHBV-MM raatioon ttestt annd tthe anaalyssis on cliiniccal apppliccatiionCai YYiheeDeparrtmeent of Labboraatorry,CChaoozhoouCentrralHHosppitaal,GGuanngdoong55210021.【Absttracct】OObjeectiive to stuudy thee suubsttancce oof bbloood i

40、immuunitty HHBV-M,AAppllyinng,tthe tecchnoologgy oof TTRFII-A tto ttestt thhe rresuult andd thhen commparre iitwiith thee reesullt oof tthe ELIISA in fixxnesss,ssenssiviity andd sppeciificcityy annd ttocoomprre-hhcndd thhe aaccuuraccy,ffeassibiilitty aand thee vaaluee off clliniicall apppliicattionn

41、 inn teestiing HBVV-M by TRFFIA.Mettfodds tto ddeteer-mminaate thee reesullt aand conntennt oof2660annd HHBV-M bby TTRFIIA aand ELIISA resspecctirrelyy.Reesullts HBssAg possitrre iis366by ELIISA,andd40bby TTRFIIA, x2=4,P00.055,thhe ffix ratte iis988.466%;aantii-HBBs pposiitivve iis1330byy ELLISAA,an

42、nd1660byy TRRFIAA, xx2=300，P0.001；tthe fixx raate is888.55%；HHBeAAg pposiitivve iis177by ELIISA,andd18bby TTRFIIA, x2=1，PP0.05；thee fiix rratee iss99.6%；Antti-HHBe possitiive is886byy ELLISAA,annd733by TRFFIA, x22=6.76，PP0.01，tthe fixx raate is990.44%；AAntii-HBBc pposiitivve iis544by ELIISA,andd72bb

43、y TTRFIIA, x2=155.6 ，P0.001，tthe fixx raate is991.55%.CCon-cluusioon TTRFIIA hhas higgherr sppeciificcityy annd ssenssitiivitty tthann ELLISAA,TRRFIAA inn teestiing HBVV-M conntennt mmay inddireectlly nnefllectt thhe vviruus iinfeectiion in cliiniccal andd offferr dyynammicss obbserrvattionn inn thh

44、e cclinnicaal iiffeectss annd bbasiis iin iinocculaatioon aa-gaainsst HHBV. Keey wwordds HHBV-M TTRFIIA EELISSA时间分辨荧荧光免疫疫测定技技术在HHBV-M定量量检测及及临床应应用分析析目前国内临临床实验验室最常常用的乙乙型肝炎炎病毒（HHBV）感感染者的的血清学学标志物物检测主主要靠EELISSA法，由由于ELLISAA法简单单、方便便、快速速的优点点在临床床得到广广泛应用用，但受受方法学学本身的的限制，它它不能提提供HBBV-MM的具体体含量，只只能作为为阴阳性性判断，故故不可能完

45、成HBVV感染的的动力学学观察，而而时间分分辨荧光光免疫技技术的出出现提供供了对HHBV-M进行行定量检检测的手手段。本本文采用用TRFFIA法法对2660份血血清标本本进行HHBV-M检测测，并与与ELIISA法法结果进进行比较较和分析析。现报报告如下下：1对象与方方法1.1对象象 血清清标本均均来自本本院门诊诊及住院院病人2260例例，无年年龄性别别要求。早早晨空腹腹抽取静脉血血，分离离血清后后产即检检测。1.2检测测试剂EELISSA试剂剂盒由上上海荣盛盛生物技技术有限限公司提提供。TTRFIIA试剂剂盒由广广州市丰丰华生物物工程有有限公司司提供。1.3仪器器 ELL-3112e酶酶标仪

46、。泰泰莱-11时间分分辨荧光光分析仪仪。Eggatee23110全自自动洗涤涤。25510变变频振荡荡器。1.4 质质控物 由卫生生部临床床检验中中心提供供。1.5 方方法 EELISSA法和和TRFFIA法法测定HHBV-M，严严格按照照试剂操操作规程程操作，同同时加入入相应质质控物监监测。1.6 统统计学方方法 采采用配对对x2检验。2结果2.1HBBsAgg ELLISAA法 结结果阳性性36例例，阳性性率133.8%；TRR-FIAA法结果果阳性440例，阳阳性率115.44%；两两法都阳阳性366例，两两法都阴阴性2220例，TTRFIIA阳性性而ELLISAA阴性44例，TTRFI

47、IA阴性性而ELLISAA阳性无无，采用用配对xx2检验，xx2=4,P00.055，差异异有显著著性，两两法比较较符合率率为2556/2260=98.46%；其中中HB-sAgg含量00.55ngg/mll占4例，625nng/mml占77例，22650nng/mml占88例，55150nng/mml占88例，1150nng/mml以上上占133例。2.2抗-HBss ELLISAA法 结结果阳性性1300例，阳阳性率550%；TRFFIA法法结果阳阳性1660例，阳阳性率661.55%；两两法都阳阳性1330例，两两法都阴阴性1000例，TTRFIIA阳性性而ELLISAA阴性330例，T

48、TR-FIAA阴性而而ELIISA阳阳性无，采采用配对对x2检验，xx2=300,P0.001，差差异有非非常显著著性，两两法比较较符合率率为2330/2260=88.5%；其中-HBss含量1101100mmIU/ml占占79例例，1002000mIUU/mll占166例，220110000mIIU/mml占446例，110000mIUU/mll以上占占19例。2.3HBBeSgg ELLISAA法 结结果阳性性17例例，阳性性率6.5%；TR-FIAA法结果果阳性118例，阳阳性率66.9%；两法法都阳性性17例例，两法法都阴性性2422例，TTRFIIA阳性性而ELLISAA阴性11例，

49、TTRFIIA阴性性而ELLISAA阳性无无，采用用配对xx2检验，xx2=1,P00.055，差异异无显著著性，两两法比较较符合率率为2559/2260=99.6%；其中HHBeSSg含量量0.0030.11NCUU/mll占1例例，0.110.55NCUU/mll占4例例，0.512NCCU/mml111例，22.18NCUU/mll12例。2.4 抗抗-HBBe EELISSA法 结果阳阳性866例，阳阳性率333%；TR-FIAA法结果果阳性773例，阳阳性率228%；两法都都阳性667例，两两法都阴阴性1668例，TTRFIIA阳性性而ELLISAA阴性66例，TTRFIIA阴性性而

50、ELLISAA阳性119例，采采用配对对x2检验，xx2=6.76,P00.011，差异异有非常常显著性性，两法法比较符符合率为为2355/2660=990.44%；其其中抗-HBee含量11.52NCCU/mml144例，22 .115NNCU/ml114例， 5.1110NNCU/ml223例，220NCCU/mml以上上24例例。2.5抗-HBcc ELLISAA法 结结果阳性性54例例，阳性性率200.8%；TRRFIAA法结果果阳性772例，阳阳性率227.77%；两两法都阳阳性522例，两两法都阴阴性1886例，TTRFIIA阳性性而ELLISAA阴性220例，TTRFIIA阴性性

51、而ELLISAA阳性22例，采采用配对对x2检验，xx2=155.6,P00.011，差异异有非常常显著性性，两法法比较符符合率为为2388/2660=991.55%；其其中抗-HBcc含量00.10.55NCUU/mll11例例，0.511NCUU/mll1例， 15NCUU/mll10例，5.110NNCU/ml336例，110NCCU/mml以上上14例。3讨论 TRFIAA法检测测HBVV-M与与ELIISA法法相比，其其特异性性和敏感感性都高高，特别别是能够够检测低低浓度HHBsAAg和HHBeAAg，对对减少HHBV感感染漏诊诊和误诊诊具有较较高价值值。因HHBsAAg阳性性是HB

52、BV感染染的金标标准11。有有学者对对血清呈呈低水平平存在、血血清HBBsAgg约在55ng/ml以以下者做做过研究究2，对象象是非肝肝炎患者者住院人人群，结结果是占占总人群群的2.34%，占HHBsAAg阳性性人群的的23.16%。而本本文只检检测出11.5%和100%。此此结果存存在一定定差异，有有待进一一步探讨讨。抗-HBss是对HHBV的的保护性性免疫指指标，有有学者认认为仍有有保护作作用的最最低抗-HBss的浓度度为100mIUU/mll，提出出基础免免疫后高高度抗体体滴度的的再接种种方案，最最后一次次接种后后4周，如如抗-HHBs10mmIU/ml立立即再接接种；1101000mI

53、UU/mll，36个月月后必须须再接种种3。实际际工作中中发现抗抗-HBBs定量量检测对对于监测测、指导导肝移值值中乙型型肝炎免免疫球蛋蛋白的应应用具有有肯定作作用。说说明了对对抗-HHBs定定量的检检测是很很有必要要的，同同时也可可了解人人体是否否有抗-HBss、是否否有足够够的量可可抵御HHBV的的侵袭。本本文抗-HBss结果显显示，1160例例TRFFIA法法阳性779例，抗抗-HBBs浓度度值在1101000mIUU/mll以内，此此量因无无确切的的抵御能能力，建建议加强强预防措措施。对对于抗-HBss阴性的的人群更更应做好好预防，至至于1000mIIU/mml以上上含量的的人群，说说

54、明他们们已有好好的抵御御能力。另另外结果果提示，EELISSA法的的抗-HHBe阳阳性率明明显高于于TRFFIA法法，由于于本身方方法学的的限制，最最好在发发出报告告时加以以综合分分析或提提高Cuutofff值。从实验结果果表明HHBV-M各项项阳性结结果都显显示了不不同的含含量，说说明了人人体感染染HBVV后，病病毒的复复制程度度或经抗抗病毒药药物治疗疗后，HHBV-M含量量也随之之变化，提提示了动动力学关关系。据据所掌握握的资料料观察，患患都治疗疗前及治治疗后HHBV-M含量量变化结结果比较较。见表表1。表1 2例例病人HHBV-M治疗疗前后结结果比较较 略略可以看出，HBsAg和HBeA

55、g逐渐下降，而所有抗体逐步增高，这说明抗病毒治疗是有效的，同时也给临床预后判断提供了依据。目前临床上上对检测测HBVV-M的的血清常常用方法法是血清清免疫学学检测，也也就是检检测患者者对病毒毒侵染机机体产生生的免疫疫反应，因因此免疫疫血清学学指标可可间接反反映病毒毒的感染染状况。随随着检测测水平的的不断提提高，TTRFIIA技术术的问世世给免疫疫自身的的研究和和发展提提供了新新的手段段。虽然然DNAA是直接接反映病病毒本身身在机体体内的存存在情况况，而人人们越来来越意识识到两者者既相关关，又不不尽一致致，高灵灵敏准确确的HBBV-MM定量结结果可与与HBVV-DNNA的检检测相互互印证，给给临

56、床提提供更客客观有效效的实验验报告，临临床上需需要将两两者结合合起来对对患者进进行综合合诊断、治治疗和预预后等判判断。如如果在没没有开展展HBVV-DNNA项目目检测的的单位，HHBV-M含量量检测其其本身也也就是一一个很好好监测病病毒动力力学变化化的辅助助指标。参考文献 陈紫榕，病病毒性肝肝炎，北北京：人人民卫生生出版社社，20002，66，1991.陈瑜，钟步步云，徐徐根云，等等.低水水平血清清乙肝病病毒表面面抗原测测定及临临床意义义。中华华检测医医学杂志志，20001，224：11.Klauss-peeterr Maaierr 著，郝郝连杰等等译.第第四版；北京人人民卫生生出版社社，19

57、997，88，355。作者单位：52110211广东省省潮州市市中心医医院检验验科病记半功肝化测知各临床科室室： 为增加加我院临临床诊断断、治疗疗和观察察病情的的参考依依据，进进一步提提高我院院的医疗疗水平和和我院的的综合竞竞争能力力。我们们要积极极开展应应用技术术、新项项目。最最近检验验科在院院领导的的大力支支持下引引进了WWALLLAC公公司生产产的时间间分辨荧荧光免疫疫分析系系统，该该时间分分辨荧光光免疫分分析系统统可进行行多种检检测（见见附录）其其中对“乙肝两两对半”可进行行准确的的定量测测定。欢欢迎各临临床科选选用医务科2002年年12月月25日日一、两对半半定量测测定乙肝病毒（HH

58、BV）标标记物的的检测方方法常用用测定乙乙肝病毒毒的抗原原、抗体体标记物物，由660年代代末700年代初初的琼脂脂扩撒法法，依次次发展为为血凝法法酶联免免疫吸附附（ELLISAA）、同同位素免免疫标记记（RIIA）化学发发光免疫疫分析、生生物发光光、电化化学发光光免疫标标记和880年代代中建立立的稀土土离子荧荧光标记记（时间间分辨荧荧光免疫疫分析）等等不同的的检测方方法。随随着科学学的发展展和检验验技术的的进步，其其方法每每发展一一步，乙乙肝标记记物检出出的灵敏敏度和准准确性都都得到不不同的提提高（其其中RIIA为110-112mool/LL、ECCL 110为110-119 mmol/L、C

59、CLIAA为100-155m oll/L、EECL110为-17/L、TTRF为为10-19 moll/L）。其其中时间间分辨荧荧光免疫疫分析（TTRF）为为近年新新研制成成功的用用三价稀稀土离子子作为示示踪物，以以单克降降抗体包包被支持持物与样样品中抗抗原反应应，再加加入有铕铕（EUU）标记记的抗体体，进行行反应检检测，可可大大降降低一般般同位素素和荧光光标记受受环境干干扰缺点点，提高高了检测测的灵敏敏和准性性，该TTRF法法检测乙乙肝病毒毒标记物物较其他他方法灵灵敏度高高、特异异性好，因因干扰因因素少可可大地优优于以上上各种方方法，可可与HBBV-DDNA的的检测相相比（未未经规范范化要求

60、求开展的的HBVV-DNNA检测测，多年年的临床床实验证证明，假假阳性、假假阴性率率较高，重重复性差差，且不不能定量量。）TTRF为为目前检检测乙肝肝病毒标标记物最最理想怕怕方法。TRF定量检测乙肝病毒“两对半”为临床诊断乙肝提供了新手段，有助于临床客观的分析HBV感染情况、疗效的观察和转归等情况的分析，至少可对一列情况更具有独特的诊断价值：治疗前进行行病毒定定量检测测，可以以指导选选择抗病病毒药物物，避免免盲目用用药。治疗后定量量间接判判断体内内病毒数数量，有有助于疗疗效的观观察。怀孕前进行行定量测测定，有有助于选选择有利利的怀孕孕时机。乙乙肝孕妇妇进行定定量检查查，有助助于使部部分病人人得