缺氧诱导因子1α在盐酸川芎嗪预处理的大鼠缺血再灌注脑组织中的

1、缺氧诱导因子-1在盐酸川芎嗪预处理的大鼠缺血再灌注脑组织中的【摘要】目的研究缺氧诱导因子-1HIF-1在缺血再灌注脑组织中的表达。方法应用RealtiePR方法，对HIF-1在盐酸川芎嗪预处理的大鼠缺血再灌注脑组织中的表达进展检测。结果缺血再灌注组、假手术组和用药组中HIF-1的RNA的表达无明显统计学差异。结论缺血缺氧并非在基因转录程度对脑组织HIF-1的表达进展诱导。【关键词】缺氧诱导因子-1缺血再灌注脑组织基因表达缺氧诱导因子-1HIF-1是一种随着细胞内氧浓度变化而调节基因表达的快速转录因子，因其可诱导血管内皮细胞因子、促红细胞生成素及诱导性一氧化氮合成酶等靶基因的转录，而成为低氧应答

2、反响的调控中心。作为治疗缺血性疾病的一种候选基因，HIF-1在缺血性疾病中具有极大的应用价值1，近年来已成为缺血性脑血管病的一个研究热点。但脑组织发生缺血再灌注后HIF-1在基因程度的表达规律和特点，以及中药对其表达的调控作用，国内外鲜见报道。本研究利用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，观察局灶性缺血再灌注对HIF-1表达的影响及中药对其表达的调控，讨论其在脑缺血再灌注发生后的表达。1材料与仪器1.1动物SD大鼠，雌雄不限，体重30020g，由南京中医药大学实验动物中心提供。1.2试剂与仪器RevertAidTFirststrandDNASynthesEiKitFerentans；DR001AKit

3、TakaRa；PT-225PeltierTheralylerPR仪JResearh；Rtr-GeneRG-3000Real-TieTheralyler荧光定量PR仪rbettReseah，Australia.；Rtr-Gene6.0分析软件。2方法2.1动物分组及造模大鼠随机分为缺血再灌注组、假手术组和用药组，每组10只。用药组于术前3d开场，每天按8g/100g体重腹腔注射盐酸川芎嗪，其余两组腹腔注射相应体积生理盐水。实验第4天采用Lnga2颈外动脉线栓法建立大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型。假手术组仅别离血管和神经，不插入线栓。用药组于缺血10in后按8g/100g体重腹腔注射盐酸川芎嗪，缺

4、血再灌注组和假手术组于同样时间腹腔注射相应体积的生理盐水。2.2标本制取于预定时间，以10%水和氯醛再次麻醉动物，37生理盐水250l经左心室灌注冲洗，直至右心耳流出清亮液体。大鼠断头后快速于冰盘上取出全脑，用锡箔包裹后置于液氮中保存。2.3Real-TiePR方法检测2.3.1总RNA提取称取组织0.1g放入装有1lTrizl的10l离心管中，在冰浴条件下匀浆至组织完全呈粉末状。参加200l氯仿，用力颠倒混匀，室温静置10in，于4，13000r/in离心30in，从每管中汲取上清液至另一1.5l离心管中，参加等体积异丙醇，混匀后-20沉淀1h。再次于4，13000r/in离心20in，弃去

5、上清液。参加500l75乙醇，洗涤沉淀。于4，13000r/in离心10in，弃上清液。参加10lDEP-ater至完全溶解，进展电泳并进展紫外分析测定。2.3.2RNA样品反转录利用RNA反转录试剂盒进展RNA反转录，反转录体系：TaKaRaTaq5Ul-1，0.13l；10Buffer，2.5l；gl2，1.5l；Dnipixture，2l；Prier120，0.5l；Prier220，0.5l；DdH2，加至25l。反响按照以下过程进展：95，2in；95，15s；60，20s；72，20s；步骤为40个循环。2.3.3荧光定量PR引物序列HIF-1：5GTGAATTTT3，5GTTGT

6、TAGTTA3，由上海欧易生物合成。PR反响产物用琼脂糖凝胶电泳检测。选择反响产物专一，没有二聚体等杂带的样品进展下一步定量PR反响。标准曲线制备：将预试验的PR产物以10倍浓度梯度进展稀释，选择1/10000，1/100000，1/1000000，1/10000000浓度的稀释产物作为标准品模版，进展荧光定量PR反响，并同时在荧光定量PR仪中输入以上4个浓度梯度的浓度数值。通过这四个标准品生成的反响数据，软件Rtr-Gene6.0根据反响的荧光实时监控数据和标准品的浓度关系，生成标准曲线。利用此标准曲线来计算在标准曲线所划定的t值。荧光定量PR反响：利用SYBRPreixExTaqPerfe

7、tRealTiekit进展荧光定量PR反响。反响体系：SYBRPreixExTaq，10.0l；Prier1，0.4l；Prier2，0.4l；DdH2，8.2l。PR反响条件：95，2in；95，15s；58，20s；72，20s；步骤为40个循环。实验结果利用软件Rtr-Gene5.0以及Exel7.0进展数据分析处理。2.4统计学处理应用SPSS10.0统计分析软件包进展数据处理，采用方差分析，P0.05为有差异即有统计学意义。3结果3.1绘制标准曲线以不同定量模板起始拷贝浓度的对数为横坐标，以t值即每个反响管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数为纵坐标，得到标准曲线见图1，r=0

8、.99992，符合要求。图1标准曲线略3.2实时荧光定量PR测定结果不同脑组织中HIF-1，18SrRNA的t值分别见图23，从图中可以观察到各样品中HIF-1的PR反响的变化趋势，根据不同脑组织中HIF-1，18SrRNA的t值，从标准曲线上计算出各样品的起始拷贝数，进而计算出目的基因和内参基因起始拷贝数的比值用于进展统计分析。统计结果说明，各组HIF-1RNA的表达无明显统计学差异。图2不同脑组织的HIF-1t值略图3不同脑组织中18SrRNAt值略4讨论HIF-1是在缺氧诱导的细胞核提取物中发现的一种DNA结合蛋白，是被公认的缺氧调节中的重要因子3，能与靶基因结合，使机体对缺氧、缺血产生

9、适应性反响。HIF-1由、两个亚基组成，其中亚基是其主要活性单位，HIF-1的生物效应是由HIF-1亚基实现的4。正常情况下，HIF-1不表达或表达很少，而在缺氧状态下，HIF-1的表达可呈时间和缺氧程度的依赖性升高，HIF-1蛋白的表达量和转录活性主要受细胞内氧浓度的调节。HIF-1通过调节其靶基因如内皮素1、促红细胞生成素、血管内皮生长因子、诱导型一氧化氮合酶等基因来发挥作用5。目前认为缺氧条件下HIF-1表达量增加的调节并不在HIF-1RNA程度，而是在HIF-1蛋白翻译后程度，即通过增加HIF-1蛋白的稳定性，抑制其降解来实现的6。本研究结果说明，缺血再灌注组、假手术组和用药组HIF-

10、1的RNA表达无明显变化，提示缺血缺氧并非在基因转录程度对脑组织HIF-1的表达进展诱导。目前已有不少学者就HIF-1在脑缺血再灌注时的表达进展了研究，但在基因程度的研究尚为数不多。本实验运用RealtiePR方法检测了HIF-1在盐酸川芎嗪预处理的大鼠缺血再灌注脑组织中的RNA转录程度，为研究HIF-1在脑缺血再灌注时的表达提供了重要实验思路和手段。【参考文献】1谭新杰,胡长林.缺氧诱导因子-1基因在成年大鼠局灶性脑缺血中的治疗作用研究J.中华医学杂志,2022,86(15)：1060.2LngaEZ,EinsteinPR,arSnS,etal.ReversibleiddleerebralarterylusinithutranitetryinratsJ.Strke,1989,20(1):84.3张薇,李假设溪,许建华,等.低氧条件下大鼠视网膜HIF-1及P53的表达及相关分析J.国际眼科杂志,2022,6(4):795.4赵荣瑞.缺氧诱导因子-1HIF-1的根底研究与临床意义J.山西医科大学学报,2022,37(3):226.5贾