黑曲霉生产纤维素酶工艺设计样本

1、黑曲霉生产纤维素酶工艺设计维素酶1.1纤维素酶的组分纤维素酶是水解纤维素及其衍生物生成葡萄糖的一组酶的总称，是由多种 水解酶组成的一个复杂酶系。纤维素酶是起协同作用的多组分酶系，国内外多数 根据纤维素酶的底物及作用的位点和释放的产物将其分为三类:(1)葡聚糖内 切酶(endo-l, 4-D-glueanase, EC3.2.1.4)来自真菌的简称 EG,又称 CMC Na 酶;来自细菌的简称Lne)。这类酶不能水解结晶纤维素如棉花和微晶纤维素等， 主要作用于纤维素内部的非结晶区和一些可溶性的底物如羧甲基纤维素和羟乙 基纤维素，随机降解3-1, 4糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还 原

2、性末端的小分子纤维素、纤维二糖和葡萄糖，其分子量大小约23-146KD。(2) 葡聚糖外切酶(exo-1, 4- 3 -D-glucanase,来自真菌简称CBH;来自细菌简称 Cex)。作用于纤维素线状分子末端，分解1, 4-3-D糖苷键，每次从底物的非还 原端切下一个纤维二糖分子，故又称纤维二糖水解酶，能够水解无定形纤维素 和微晶纤维素，对棉花有微弱的作用分子量约38-118KDo (3)3-葡萄糖苷酶(3 -D 一 glucosidase,简称BG)纤维素大分子首先在GE酶和CBH酶的作用下降解 为纤维二糖，再由BG酶水解成二个葡萄糖分子。其分子量约为76KD。1.2纤维素酶的作用机制当

3、前对纤维素酶的分子机制大致有3种假说:改进的Cl 一 Cx假说、顺序作 用假说和竞争吸收模型。它们都认为，纤维素酶降解纤维素时，先吸附到纤维素 表面，然后其中的内切酶在葡聚糖链的随机位点水解底物产生寡聚糖，外切酶 从葡聚糖链的还原或非还原端进行水解产生纤维二糖，3 -葡萄糖苷酶水解纤维 素二糖为葡萄糖。在纤维素溶解糖化过程中内切酶和外切酶的比值会显著地影响 纤维素溶解活力，而且在纤维素糖化过程中3-葡萄糖普酶组分的加入会使这种 协同作用大大加强 应该注意的是，这种协同作用不但作用顺序不是绝正确， 而且各酶的功能也不是简单、固定的。研究表明，GE和CHB都能引起纤维素的 分散和脱纤维化（沿纤维素

4、的经度轴方向分层，形成更薄更细的亚纤维），这样 纤维素的结晶结构被打乱，导致变形，使纤维素酶能深入纤维素分子界面之间， 从而使纤维素孔壁、腔壁和微裂隙缝的压力增大，水分子的介入又使纤维素分 子之间的氢键被破坏，产生部分可溶性的微结晶，利于进一步被降解。1.3纤维素酶在实际生产中的应用据统计，1995年，世界工业酶的销售量大于10亿美元;而1999年实际达 到16亿美元。工业酶总供应量的60%来自于欧洲，其余40%来自于美国和日本， 而且大约75%的工业酶是水解酶，其中糖营水解酶居第二位17。当前纤维素酶 的应用还主要集中在微生物纤维素酶的应用上。现在纤维素酶已被广泛地应用于 食品、酿酒、饲料加

5、工、纺织、洗衣、农业、医药等多个领域中。1.3.1纤维素酶在食品加工行业的应用纤维素酶在食品加工行业应用极为广泛。在果蔬加工行业中，纤维素酶用来 软化植物组织。和一般的加热蒸煮、酸碱处理等方法相比，采用纤维素酶处理 能够避免营养物质特变是维生素的流逝。采用纤维素酶水解法对海藻粉进行前处 理能够提高海藻脂质的抽提率，充分获取海藻中的脂质资源，同时降低生产成 本。在油料作物加工中，传统的压榨法和有机溶剂法生产的油制品存在质量差产 量点的缺点。用纤维素酶代替有机溶剂进行加工，能够避免有机溶剂的残留，因 而能提高产品质量;另外酶反应条件温和，能够避免剧烈条件对产品质量的影响, 同时也降低了生产成本。在

6、酿酒行业中，原材料中纤维素含量很高，加入纤维素 酶，使纤维素能转换为糖，原料利用率大大提高，且残渣相对锐减，不但提高 了产量，同时使残渣处理的工作量减少，极大的提高了经济效益。1.3.2纤维素酶在饲料工业中的应用由于家禽家畜一般难消化利用纤维素和半纤维素。而在饲料中加入纤维素酶 制剂后，使纤维素和半纤维素转化为易吸收利用的糖类，使饲料得以充分的利 用，同时也避免纤维素和半纤维素在动物体内累积，促进动物的消化吸收。1.3.3纤维素酶在纺织工业中的应用近年来，人们经过微生物工程技术，利用纤维素酶对纺织品进行后处理。因 为纤维素酶能使麻、棉这类富含纤维素的物质表面剥离和纵向复合细胞间层侵 蚀，使纤维

7、梢丝束化或者脱落，因此，经纤维素酶处理过的织物比较蓬松、丰 满、柔软、滑爽，且悬垂性好，吸湿性强，具有一定的丝光效果。有效地提高 了棉麻织物的服用性能及产品的档次。1.3.4环境保护和纤维素废料处理自然界和工农业生产中都有大量含纤维素的废物，如木屑、废纸等纤维滤 渣，这些废料经理化方法处理后易于酶解M,就能够用纤维素酶将其水解。如利 用纤维素酶处理秸杆、蔗渣等农业废料生产葡萄糖，再经过发酵可生产甲醇、 乙醇等工业物质，这些不但是重要的化工原料，还能够替代汽油等作为燃料解 决日益紧张的能源问题。1.3.5在医药中的应用中草药所含成分十分复杂，既有有效成分，又有无效成分和有毒成分。为了 提高中草药

8、的治疗效果，就要尽最大限度提取有效成分，去除无效成分及有毒 成分。因此，中草药提取对于提高中药制剂的内在质量和临床疗效最为重要。但 常见的提取方法（如煎煮法、回流法、浸渍法、渗流法等）在保留有效成分，去 除无效成分方面，存在着有效成分损失大、周期长、工序多等缺点。近年来，用 于中药提取方面研究较多的是纤维素酶，该方法的应用，使得中草药提取既符 合传统的中医理论，又能达到提高有效成分的收率和纯度的目的。大部分的中药 材的细胞壁是由纤维素构成，植物的有效成分往往包裹在细胞壁内，用纤维素 酶酶解能够使植物细胞壁破坏，有利于有效成分的提取。1.4纤维素酶的分离纯化基本用于分离蛋白质的方法都能够用来分离

9、纤维素酶。纤维素酶常见的分离 纯化方法有:有机试剂沉法、盐析法、电泳法、离子交换层析法、分子筛层 析法等。无水乙醇和丙酮是最常见来沉淀的有机溶剂，沉淀再经离心分离、风 十，即得到较纯的酶制剂。盐析常见的试剂为硫酸按，操作简单，缺点是存在酶 活的损失，且除盐困难15。电泳法和离子交换法都是依据物质的酸碱性、极差 的差异，经过离子间的交换吸附实现组分分离的方法，缺点是当杂质与所要分 离的物质具有相类似的极差时，难以分离出杂质。分子筛层析是利用具有一定孔 径的分子筛对物质按分子大小进行分离，方法简便，缺点是当杂质和所分离物 质分子大小接近时，达不到分离的目的。除了以上常见的分离方法外，双水相萃 取技

10、术、色谱技术也应用于纤维素酶的分离。双相萃取技术又称水溶液两相分 配技术，分离过程温和，酶不易被破坏，且不需要苛刻的条件16纤维素酶本身 就是一个多组分的酶系统，实际生产中又不可避免得引入一些杂质，因此，要 得到纯组分的纤维素酶，往往需要多种分离手段联合应用才能实现。产生纤维素酶的微生物纤维素酶的来源很广泛，真菌，细菌，放线菌等均有能产生纤维素酶。细菌有纤维粘菌(CytoPHaga)和纤维杆菌(Cellulomonas)等。放线菌主要有玫瑰色放线菌(A.Roseus)和纤维放线菌(A.Cellulase),链 霉属放线菌等。不同微生物合成的纤维素酶在组成上有显著的差异，对纤维素的 酶解能力也不

11、大相同。放线菌的纤维素酶产量极低，研究很少。细菌的产量也不 高，主要是葡聚糖内切酶，且大多数对结晶纤维素没有活性，所产生酶是胞内 酶或吸附在菌壁上，很少能分泌到细胞外，增加提取纯化难度，在工业上很少 应用。当前国内外最主要的还是利用真菌来发酵产纤维素酶。真菌具有产酶的诸多 优点：产生纤维素酶为胞外酶，便于酶的分离和提取；产酶效率高，且产生纤维 素酶的酶系结构较为合理；同时可产生许多半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等。 真菌纤维素酶主要有木霉 (Trichoderm)青霉(penicillium)、 曲霉 (Aspergillus)以及腐质霉(Humicola)等。其中研究得比较深和透彻的是木霉属 (

12、Trichoderma)和曲霉(Aspergillus),绿色木霉和黑曲霉被公认是产纤维素酶 最稳定和无毒安全的菌种，且其产生的是胞外酶对研究纤维素酶的性质以及分 离纯化等都比较方便。2.1绿色木酶简介绿色木霉(Trichoderma viride)为腐生菌，主要存在于朽木、枯枝、落叶、 土壤、有机肥、植物残体和空气中。其分生抱子经过空气传播。菌株在马铃薯一葡萄糖琼脂培养基上广铺，最初为白色致密的基质菌丝，而 后出现棉絮状气生菌丝，并形成密实产抱丛束区，常排成同心轮纹。深黄绿色至 深蓝绿色的产抱区，菌落反面无色，老的培养基散发一股椰子气味，菌丝透明， 壁光滑，有隔，分枝繁复，直径1.512m,

13、透明。厚垣抱子间生于菌丝中顶生 于短侧枝上，多数为球形，极少为椭圆形，透明，壁光滑，直径可达14um, 一般在基底菌丝中产生.分生抱子梗的特征同属的特征。小梗瓶形或锥形，基部 稍窄，中部较宽，从中部以上变窄成长颈，近于直或中部弯曲，814X2.54.5 um,分生抱子大多为球形，直径254.5 u m,少数抱子为短倒卵形，45X 3.54um,抱壁具明显的小扰状突起，在显微镜下单个抱子淡绿色。在分生抱子 梗分枝上聚成的孢子头89林um。绿色木霉生产纤维素酶产量比较高，能够经过物理或化学诱变获得高产菌株, 能够稳定地用于生产;该霉菌要求的生长环境粗放，适应性较强，易于控制，便 于管理;绿色木霉产

14、生的纤维素酶稳定性比较好，培养和控制比较容易；该霉菌 分泌的纤维素酶是胞外酶，易于分离纯化;另外，绿色木霉及其代谢物安全无毒, 不会对操作人员和环境造成不良的影响。因此，绿色木霉是当前用于纤维素酶生 产的最普遍的菌种之一。2.2黑曲霉简介黑曲霉是半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属的一种常见真 菌（曹澍泽等，1992）。广泛分布于植物性产品、籽实和土壤中，可生产淀粉 酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、单宁酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、 葡糖酸和没食子酸等，是一种重要的发酵工业菌种。当前，国内外对纤维素酶的研究多集中于木霉。可是木霉毒性嫌疑大，在食 品发酵工业和饲料工业中的应用受到限制，而黑

15、曲霉被认为是不会产生毒素的纤 维素酶产生菌。现已被许多国家批准作为食品用酶制剂生产菌，国外已实现黑曲 霉酶制剂商品的工业化生产生产纤维素酶的工艺介绍纤维素酶的生产主要有固体发酵和液体发酵两种方法，生产原料有麸皮、秸秆粉、废纸、玉米粉和无机盐等。3.1纤维素酶的发酵工艺3.1.1固态发酵随着固体发酵生产线的相继建成投产，以及市场竞争对低成本高产出的迫 切需求，固体发酵已日益受到注目。固态发酵是指利用不溶性原料作为固体支持 物和营养物质，体系无自由流动液体，在其上进行的任何发酵过程。固态发酵 历史悠久，应用广泛，是人类利用微生物生产产品历史最悠久的技术之一。自 20世纪90年代以来，随着能源危机和

16、环境问题的日益严重，人们重新开始审视 固体发酵的优点，并不断在原料、工艺和设备等方面进行大量深入的研究，使 固态发酵在酶制剂领域取得了长足的进展。其工艺流程如下斜面试管f小三角瓶培养f大三角瓶培养f种子罐培养!原料f粉碎f配料f混合一蒸煮灭菌冷却接种（稻草等）（麸皮、营养盐等）!成品一包装一干燥一过滤一盐析一浓缩一过滤一浸提一固体发酵3.1.2液体发酵液体发酵法是将玉米秸杆粉碎至20目以下进行灭菌处理，送入发酵釜内发 酵，同时加入纤维素酶菌种，发酵时间约70h,温度低于60C。采用无菌空气从 釜底通入进行通气搅拌，发酵完的物料经压滤机压滤，超滤浓缩和喷雾干燥后 制得纤维素酶产品。其生产工艺流程

17、下图所示。斜面试管f小三角瓶培养f大三角瓶培养f种子罐培养!原料f粉碎f 配料f混合f蒸煮灭菌冷却接种（稻草等） （麸皮、营养盐等）!成品一包装一喷雾干燥一超滤浓缩一压滤一液体深层发酵此法具有原料利用率高、生产条件易控制、劳动强度小、产品质量稳定、 不易染菌、生产效率高等特点，但缺点是动力消耗大、设备要求高。当前，应用于生产纤维素酶的菌种主要是木霉、黑曲霉和变异青霉等，其 中木霉应用最广泛。纤维素酶的生产和其它酶制剂一样，可采用液体培养(包括 液体浅盘培养和深层通气培养)和固体培养(包括固体浅盘培养和厚层通风培养) 两种。美国在原有的液体培养方法的基础上发展出了流加培养法、分批发酵法、 连续发

18、酵法、二次发酵法以及细胞循环法等等6从现有的研究结果来看，纤 维素酶的生产以固态发酵居多，而且较为经济合理。其原因主要有以下几个方 面：固态发酵能耗低，一般不需搅拌，只需通入少量低压无菌空气。液态发 酵的通气量比固态发酵大得多，而且进气压力也较高。另外培养液粘度大，氧的 传质困难，需要消耗大量的动力做搅拌功；固态发酵原料及培养条件比较粗放，成本较低；固态发酵设备投资少，后处理简单，基本无污染。液态发酵设备投资大， 技术要求高，需要排放大量污水。大量的实验表明，由于丝状真菌的菌丝体在固态发酵中能够很好地与纤 维质原料结合，因此，固态发酵的酶活要比液态发酵高。当然，固态发酵也存在着一些不足：机械化程度低，劳动强度大；产品质量 不稳定，